谢木娇 区又君 温久福 李加儿 周慧 王鹏飞 刘奇奇

摘要：【目的】研究四指马鲅消化道黏液细胞的发育规律，为指导四指马鲅育苗过程中适时更换饵料及制定投饵策略、完善育苗工艺和提高育苗成活率提供参考依据。【方法】利用组织石蜡切片和阿利新兰—高碘酸雪夫试剂（AB-PAS）染色，观察研究1～30日龄四指马鲅消化道黏液细胞的发生过程。【结果】四指马鲅的食道最早在5日龄时出现II型黏液细胞；9日龄仔鱼食道黏液细胞数量有所增加，胃部已有贲门部、幽门部、胃体部和盲囊部的明显区域分化，黏膜皱褶丰富，各区域大部分的黏膜表面均有I型黏液细胞分布；15日龄仔鱼胃腺区域出现II型黏液细胞，肠道前、中、后段均出现II型黏液细胞，且以圆形为主；17日龄仔鱼幽门盲囊区域出现II型黏液细胞；23和30日龄仔鱼消化道黏液细胞以II型为主，数量持续增加。四指马鲅消化道各段黏液细胞密度、大小及分泌能力均随日龄的增加而增加，且同日龄仔鱼消化道中以食道的黏液分泌能力最强。【结论】四指马鲅消化道黏液细胞的发生和分布特征与仔鱼摄食能力日益增强及消化道结构逐渐完善的趋势相适应。

关键词： 四指马鲅；消化道；黏液细胞；发生；分布；开口摄食

中图分类号： S965.329 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1222-06

0 引言

【研究意义】四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）隶属于鲻形目（Mugiliformes）马鲅亚目（Polynemoidei）马鲅科（Polynemidae）四指马鲅属（Eleutheronema）（孙典荣和陈铮，2013），广泛分布于热带和温带的砂石底海区，如澳大利亚东西海岸、美国夏威夷海域、印度尼西亚海域等（Zischke et al.，2009；Moore et al.，2011；Newman et al.，2011；Ballagh et al.，2012），我国的黄海、渤海、东海和南海也有分布（Wang et al.，2014），目前在我国台湾、广东、海南、浙江等地已有人工养殖。黏液细胞随着机体的生长发育，其成分、形态和分布均会发生明显变化，可作为检测消化道功能发育的一项参考依据（谢木娇等，2015），而消化道的结构发育与功能完善又直接影响仔稚鱼对营养物质的吸收利用及其成活率，因此，研究观察鱼类消化道黏液细胞的發育规律对揭示仔稚鱼消化道的变化规律及苗种培育具有重要意义。【前人研究进展】黏液细胞分泌的黏液物质包含水解酶、糖蛋白、免疫蛋白、黏多糖等多种活性物质，进而形成协调机体内外环境平衡的黏液屏障（Khojasteh et al.，2009），在润滑食物、协助消化吸收、抗菌、抗病毒及离子转运方面发挥作用（Sarasquete et al.，2009）。近年来，已有关于不同鱼种消化道黏液细胞发育的研究报道，如波纹唇鱼（Cheilinus undulates）（王永波等，2010）、点带石斑鱼（Epinephelus malabaricus）（李鑫炜等，2012）、哲罗鱼（Hucho taimen）（关海红和尹家胜，2013）、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）（张建业等，2014）等。李鑫炜等（2012）研究表明，点带石斑鱼黏液细胞出现的日龄与开口摄食日龄一致，即黏液细胞的存在可能是仔稚鱼开口摄食的前提。关海红和尹家胜（2013）研究发现，哲罗鱼黏液细胞发生的部位分别是口咽腔、消化道，黏液细胞开始为囊状，随后发育成梨状，最终发育为杯状。张建业等（2014）研究发现，泥鳅仔鱼3日龄时口腔、食道出现黏液细胞，7日龄时消化道开始出现黏液细胞，且黏液细胞的类型按幼稚型到成熟型的规律发生，并认为3～10日龄是泥鳅仔鱼消化道发育的敏感期，20日龄左右消化道功能发育逐渐完善。【本研究切入点】除本课题组研究报道过四指马鲅稚鱼、幼鱼和成鱼消化道黏液细胞的组织化学（谢木娇等，2015）外，至今未见有关四指马鲅消化道黏液细胞发育的研究报道。【拟解决的关键问题】针对仔鱼在培育过程中呈现生长迅速的特点，从功能细胞角度分析四指马鲅仔鱼消化机能的发育规律，为指导其育苗过程中适时更换饵料及制定投饲策略、完善育苗工艺和提高育苗成活率提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 苗种来源

四指马鲅受精卵和初孵仔鱼由本课题组在南海水产研究所珠海试验基地培育获得。仔鱼先在室内水泥池培育7 d后转移到室外土池继续培育，各阶段培育条件：水温29～32 ℃，盐度25‰～28‰，溶氧4.80～5.50 mg/L，pH 8.00～8.30，氨氮含量0.20～0.40 mg/L，亚硝酸盐含量0.005～0.015 mg/L。培育过程中仔鱼饵料系列为轮虫、小球藻、枝角类（2～15日龄）→卤虫无节幼体和部分红虫（16～30日龄）→粉状配合饲料和鱼肉糜或贝肉糜（31～50日龄）。孵化后第1 d的仔鱼为1日龄，以此类推，培育過程中对1～30日龄的鱼苗进行连续采样，每次取样20尾用10%中性甲醛固定，期间定期更换固定液以延长样品的保存时间。

1. 2 样品处理及分析方法

采集样品中每个日龄段的仔鱼取10尾进行常规石蜡切片制作，切片用阿利新兰—高碘酸雪夫试剂（AB-PAS）进行染色（AB-PAS试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司），具体染色步骤参照试剂盒说明进行操作，在显微镜下观察拍照。根据AB-PAS显色结果将黏液细胞分为I型、II型、III型和IV型，分别呈红色（含PAS阳性的中性黏多糖）、蓝色（含AB阳性的酸性黏多糖）、紫红色（主要含PAS阳性的中性黏多糖，同时含少量AB阳性的酸性黏多糖）和蓝紫色（主要含AB阳性的酸性黏多糖，同时含少量PAS阳性的中性黏多糖）。同时参照王永波等（2010）的方法统计消化道各段各类型黏液细胞的密度、细胞长短径及消化道各段的分泌能力[单位面积黏液细胞密度与细胞表面积（π×长径×短径/4）的乘积]，其中细胞密度统计样本为消化道各段取3张相邻切片随机选10个视野，分别测量每个视野中1 mm2范围内各类型黏液细胞的总数，同时测量黏液细胞（n=10）的长径和短径。试验数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比较。

2 结果与分析

2. 1 黏液细胞的发生过程

1～4日龄四指马鲅仔鱼消化道由简单的直线管发育到基本与外界连通状态，包括食道、胃部和肠道基础的分化，但黏膜上皮间未见有黏液细胞分布。5日龄仔鱼食道形成1～2个黏膜皱褶，上皮基底层和中间层出现少量II型黏液细胞，均为圆形且被染成深蓝色的细胞，胞质均匀（图1-1）；胃肠黏膜皱褶增多变扁平，其黏膜边缘呈淡蓝色，但仍未见有黏液细胞分布。9日龄仔鱼食道黏液细胞仍是圆形的II型黏液细胞（图1-2）；胃部呈Y形，贲门部、幽门部、胃体部和盲囊部呈明显的区域分化，黏膜皱褶丰富，各区域大部分的黏膜表面被染成浅红色，为含中性黏多糖的I型黏液细胞；肠道仍无前、中、后肠的分化，上皮间未见黏液细胞。15日龄仔鱼胃部以I型黏液细胞为主，但在有胃腺分布的区域（除幽门部外）分布有蓝色的II型黏液细胞（图1-3），肠道前、中、后段也出现蓝色的II型黏液细胞，且以圆形为主（图1-4和图1-5）。17日龄仔鱼食道上皮分布有大量的II型黏液细胞，复层上皮因黏液细胞密集而被染成深蓝色，部分细胞染色较浅呈空泡状（图1-6），胃部胃腺区域的II型黏液细胞数量增多，黏膜表层检测出蓝色（II型）和红色（I型）交替的黏液细胞线，幽门盲囊区域形成4～6个管腔，均可检测出II型黏液细胞（图1-7）。23和30日龄仔鱼消化道黏液细胞类型维持不变，以II型为主，但数量持续增加（图1-8～图1-15）。

2. 2 消化道各段黏液细胞密度的变化

由表1可以看出，四指马鲅消化道各段的黏液细胞密度随日龄增加呈显著的增加趋势（P<0.05）。5日龄仔鱼食道开始分化出黏液细胞，密度为52.09±1.01个/mm2，发育至9、15、17、23、30日龄时分别为161.45±0.90、259.98±12.34、216.65±12.82、471.62±10.38和1489.49±8.45个/mm2；幽门盲囊黏液细胞发生时（17日龄）的密度为200.65±8.30个/mm2，23日龄时增加至590.38±2.91个/mm2，30日龄时达687.45±3.81个/mm2；肠道从15日龄起出现黏液细胞，密度为239.98±9.31个/mm2，至30日龄时达462.72±10.29个/mm2。

2. 3 消化道黏液细胞大小变化及各段的分泌能力

四指马鲅消化道各段黏液细胞的大小也随日龄的增加而增大，其中以食道黏液细胞大小增长最明显（表2）。黏液细胞大小与其密度的乘积可用于衡量消化道各段的黏液分泌能力，由表3可知，四指马鲅消化道各段的黏液分泌能力亦随日龄的增加而不断提高，同日龄仔鱼消化道中以食道的黏液分泌能力最强。

3 讨论

3. 1 四指马鲅消化道黏液细胞发生的规律

黏液细胞的成分差异可反映魚类发育阶段（Leknes，2010，2011；辛俭等，2013）。四指马鲅仔鱼消化道最早（5日龄）在食道黏膜出现II型黏液细胞，而胃部最先（9日龄）出现I型黏液细胞，随着日龄增加才逐渐出现II型黏液细胞，幽门盲囊在17日龄时可检测到II型黏液细胞，肠道最先（15日龄）发育的是II型黏液细胞，同时含有少量I型黏液细胞，且消化道各段在30日龄时均未见III型和IV型黏液细胞。四指马鲅的I型和II型黏液细胞均为幼稚型黏液细胞，仅含有单一种类的黏多糖，与点带石斑鱼（李鑫炜等，2012）、泥鳅（张建业等，2014）的消化道黏液细胞发育特点相似，表明在鱼类的早期发育过程中，黏液细胞与消化道自身发育有紧密联系，黏液细胞从幼稚型向成熟型转变体现了消化道结构从发生到成熟的变化过程。本研究发现，四指马鲅仔鱼在不同日龄中消化道各段所含的黏液细胞总密度各不相同，分泌能力也存在日龄和部位的差异，即反映消化道各段在执行消化吸收功能的地位，其中以食道在不同日龄中的黏液分泌能力最强，表明食道在协助食物消化吸收过程中发挥了重要作用。大多数硬骨海水鱼类食道被覆复层的黏膜上皮并分布有大量黏液細胞（Díaz et al.，2008），由其分泌的黏液物质在保护黏膜上皮免受机械损伤和细菌入侵及离子吸收等方面发挥作用（Díaz et al.，2006）。此外，四指马鲅为肉食性鱼类，食道很短，借助其发达的肌肉层和黏膜层实现摄入足量食物进行机械消化的目的，而丰富的黏液物质有利于润滑食物使其快速往胃部推送。

3. 2 四指马鲅消化道早期发育中黏液细胞的功能

四指马鲅早期发育的消化道黏液细胞发育顺序为II型→I型，其中II型黏液细胞在17日龄后整个消化道均有分布，尤其在食道和肠道分布较多，其分泌的酸性黏液物质（主要含有酸性糖蛋白复合物）与含中性糖蛋白的黏液物质不同，可增加表面黏液的黏性（Kumari et al.，2009），以此润滑食物（鱼类摄入的一些软体动物、甲壳类小型鱼类和昆虫等）并保护黏膜表面，还起到协助机体对食物的转运和吞咽作用，而且肠道是吸收营养物质及清除有害微生物的场所，富含的II型黏液细胞可能与刺激黏膜免疫发生有关（Khojasteh et al.，2009）。本研究中，5日龄四指马鲅仔鱼食道开始出现II型黏液细胞，随着日龄的增加，消化道II型黏液细胞数量呈明显的增加趋势，但未见其他类型（III型、IV型）黏液细胞，故推测II型黏液细胞在仔鱼早期发育过程中维持机体正常消化功能和形成一定黏膜免疫能力方面占主导地位。四指马鲅仔鱼在3日龄时开口，体内消化道与外界连通，消化道具备简单的摄食和消化能力，但尚未分化完备的消化器官，随着营养方式转变为外源性营养，摄食同时也增加了有害微生物入侵的机会，分泌酸性黏液物质的II型黏液细胞在一定程度上能协助食物消化吸收及提高机体抵御不良环境的能力；四指马鲅肠道从15日龄开始分化出II型黏液细胞和少量I型黏液细胞，其中I型黏液细胞分泌的中性黏多糖常与碱性磷酸酶共存，有利于乳化食物，且中性黏液物质可作为酶解食物过程中的必需辅助因子（Carrassón et al.，2006），表现为吸收功能与防御能力相协调。四指马鲅从9日龄起胃部黏膜开始出现I型黏液细胞，且数量随日龄的增加而增加，营造出中性黏液环境以利于食物的快速消化，与平鲷（Rhabdosargus sarba）（勾效伟等，2008）、黄鳍鲷（Sparus latus）（王永翠等，2012）、黄斑篮子鱼（Siganus oramin）（区又君等，2013）的研究结果相似。

3. 3 研究黏液细胞发育对育苗的指导意义

在仔鱼培育过程中，选择适口饵料与及时更换饵料并制定投饵策略是提高育苗成活率的关键措施之一。已有研究发现，黏液细胞的出现与仔稚鱼开口日龄具有一致性，且黏液细胞的存在可能是仔鱼开口的前提（李鑫炜等，2012）。张建业等（2014）研究发现，泥鳅在开口时（3日龄）口咽腔即出现酸性黏液细胞，且其分泌的黏液物质在仔鱼进入外源性营养期间对食物的消化起主要作用。但本研究发现，四指马鲅仔鱼的开口日龄（3日龄）与黏液细胞发生日龄（5日龄）并不一致，可能与种属特异性、培育环境及仔鱼营养方式转变有关，仔鱼开口前由卵黄囊提供营养物质，为内源性营养期，开口摄食后由于消化道发育尚不完善，并未直接进入完全外源营养阶段，而是经历短暂的混合营养期，此期间（3～5日龄）尚未分化出黏液细胞，表明此阶段仔鱼体内执行消化功能的并非黏液细胞分泌的黏液物质。至5日龄时卵黄囊吸收完毕，消化道结构得到发育的同时出现黏液细胞，消化机能进一步提高，使得仔鱼具备独立摄食、消化和吸收的能力，进入完全外源性营养期成为可能。值得注意的是，虽然仔鱼在5日龄时出现黏液细胞，但分泌黏液物质单一且量不多，消化吸收能力较差且应对不良环境的能力较低，极易感染疾病，因此，此阶段除了要保证饵料充足外，还应加强仔鱼培育的日常管理。

4 结论

四指马鲅消化道内黏液细胞按食道、胃部、肠道、幽门盲囊的次序发生，其类型从II型→I型的顺序出现，且不同部位黏液细胞密度、大小及分泌能力均随日龄的增加而增加，黏液细胞这种发生和分布的特征与仔鱼摄食能力日益增强及消化道结构逐渐完善的趋势相适应。

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（責任編辑 兰宗宝）