张迪 吉薇 吉宏武 高静 丰险

摘要：【目的】利用响应面法对南极磷虾酶解液的脱氟工艺条件进行优化，为南极磷虾在食品工业中开发应用提供技术依据。【方法】在单因素试验的基础上，以脱氟率（Y）为响应值，选择醋酸钙添加量（A）、初始pH（B）、反应温度（C）为自变量，采用Box-Bohnken试验设计方法，研究各自变量及其相互作用对南极磷虾酶解液脱氟率的影响，并分析酶解液中主要营养成分的变化。【结果】建立二次回归方程：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2；醋酸钙添加量、初始pH及醋酸钙添加量与反应温度的交互作用对南极磷虾酶解液脱氟率的影响极显著（P<0.01）。南极磷虾酶解液脱氟工艺的最佳条件为：醋酸钙添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反应时间140 min、反应温度30.24 ℃，在此条件下的脱氟率为（84.15±1.37）%，与理论预测值（85.37%）的相对误差较小。在最佳条件下脱氟后，酶解液中总氮和氨基态氮含量分别损失3.11%和2.52%，反应前后含量变化不显著（P>0.05）。【结论】采用响应面法优化得到的南极磷虾酶解液脱氟工艺具有操作简单、对酶解液的营养成分影响较小等优点，有较高的可行性；建立的回归模型可用于实际预测。

關键词： 南极磷虾；酶解液；脱氟；醋酸钙；响应面法

中图分类号： TS254.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1187-06

0 引言

【研究意义】南极磷虾（Euphausia superba）是重要的蛋白质资源之一，全球总储量达3.79亿t（Atkinson et al.，2011）。南极磷虾营养丰富，含有钠、钙、铁、钾、磷等多种矿物质元素及人体必需的全部氨基酸，且不饱和脂肪酸、磷脂和类胡萝卜素的含量丰富，具有很高的食用价值（Yoshitomi，2004；孙雷等，2008）。氟是人类必需的微量元素之一，每日摄入量不能超过4～5 mg，少量的氟有助于牙齿和骨骼正常发育，但摄入量过高会导致骨质疏松症和神经系统损伤，甚至出现无法站立、瘫痪等症状（Meenakshi and Maheshwari，2006；Wang et al.，2011）。南极磷虾具有富集氟的特性（Tou et al.，2007），其酶解液存在氟含量过高的问题，限制了其开发利用，因此有必要先对磷虾酶解液中的氟进行脱除，才能被用于食品开发。【前人研究进展】目前，已有不少降低南极磷虾制品中氟含量的方法，包括酸洗法、化学沉淀法（Yang et al.，2001）、电解法（Tahir，2005）、吸附法（Tripathy et al.，2006）等。酸洗法和化学沉淀法简单方便，是南极磷虾较常用的处理方法。酸洗法是利用酸对整只磷虾、磷虾匀浆物或煮熟的粉碎磷虾肉进行处理，将磷虾中无机氟转变为游离态的氟离子除去；此法能除去磷虾中的部分氟，但会破坏产品的组织特性和风味，使磷虾中的营养物质大量损失（Jung et al.，2013）。化学沉淀法主要采用可溶性钙盐，使F-和Ca2+生成CaF2沉淀除去，该方法操作简单、成本低廉，具有良好的应用前景。已有研究以氯化钙（李红艳等，2011）、生石灰（吕传萍等，2012）等无机钙作为脱氟剂处理南极磷虾酶解液，可去除酶解液中大部分的氟。但无机钙在食品加工中作为食品添加剂不宜大量使用，反应后会使酶解液产生苦味和酸涩味，影响其在食品工业中推广应用（李春发，2012）。【本研究切入点】醋酸钙是常用的食品添加剂，在食品工业中一直作为螯合剂、增香剂、稳定剂等（郑海鹏和董全，2008）。但目前鲜见利用响应面法优化南极磷虾酶解液醋酸钙法脱氟工艺的研究报道。【拟解决的关键问题】以醋酸钙为钙源，脱氟率为考察指标，在单因素试验基础上，采用响应面法优化南极磷虾酶解液的脱氟工艺，为南极磷虾在食品工业中开发应用提供技术依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

南极磷虾由湛江国联水产开发股份有限公司提供，冷冻方式运到实验室，贮藏于-70 ℃冰箱。醋酸钙、高氯酸、氟化钠、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、冰乙酸、柠檬酸钠、乙酸钠等试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器设备：PF-1氟选择电极（上海雷磁精密仪器有限公司）、232-01型甘汞参比电极（上海雷磁精密仪器有限公司）、KQ-500DE型数控超声波清洗器（常州国华电器有限公司）、MS300磁力搅拌器（上海精密科学仪器有限公司）、WFO-700型恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、PHST-3F酸度计（上海雷磁精密仪器有限公司）、GL-10LND型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 南极磷虾酶解液制备 南极磷虾切碎，用分散均质机以10000 r/min均质5 min，均质后的浆液加入900 U/g混合酶（150000 U/g動物蛋白水解酶∶140000 U/g风味酶=1∶1），于50 ℃下搅拌反应4 h，反应完全的酶解液在离心力4000 g的条件下离心5 min，取离心后的上清液于4 ℃存放备用。

1. 2. 2 脱氟率计算 采用氟离子选择电极法（GB/T 5009.18-2003）测定氟离子含量，并计算脱氟率。

脱氟率（%）=1-脱氟后酶解液氟含量/脱氟前酶解液氟含量×100

1. 2. 3 单因素试验

1. 2. 3. 1 醋酸钙添加量的选择 在南极磷虾酶解液中分别添加1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mg/mL的醋酸钙，pH调至10.0，25 ℃搅拌反应1 h，测定反应后酶解液脱氟率。

1. 2. 3. 2 初始pH的选择 将酶解液pH分别调至7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，添加20.0 mg/mL醋酸钙，25 ℃搅拌反应1 h，测定反应后酶解液脱氟率。

1. 2. 3. 3 反应温度的选择 在酶解液中添加20.0 mg/mL醋酸钙，pH调至10.0，分别于4、10、20、30、40、50和60 ℃下搅拌反应1 h，测定反应后酶解液脱氟率。

1. 2. 3. 4 反应时间的选择 在酶解液中添加20.0 mg/mL醋酸钙，pH调至10.0，25 ℃搅拌分别反应20、40、60、80、100、120、140、180、220和260 min，测定反应后酶解液脱氟率。

1. 2. 4 响应面试验设计 在单因素试验结果的基础上，根据Box-Bohnken设计方法，选择对南极磷虾酶解液脱氟率影响较大的3个因素（醋酸钙添加量、初始pH、反应温度），取-1、0、1代表变量的3个水平，以脱氟率为响应值建立二次响应面分析模型。共进行17个试验，其中12个为析因点，5个为零点用于估算误差。每个试验重复3次，试验结果表示为测定结果的平均值±标准偏差。响应面因素与水平见表1。

1. 2. 5 酶解液中营养物质的变化分析 取少量脱氟前后的酶解液，分析脱氟过程中营养物质的变化。采用凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）测定总氮，甲醛滴定法（GB 18186-2000）测定氨基态氮，分别计算总氮和氨基态氮损失率。

总氮损失率（%）=1-脱氟后酶解液总氮含量/脱氟前酶解液总氮含量×100

氨基态氮损失率（%）=1-脱氟后酶解液氨基态氮含量/脱氟前酶解液氨基态氮含量×100

1. 3 统计分析

试验数据采用Design-Expert 8.0.5、Origin 7.0和Excel 2007进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 氟离子标准曲线的绘制

根据国标GB/T 5009.18-2003中的氟离子选择电极法绘制氟离子标准曲线，得到标准曲线的线性回归方程为y=-46.115x+240.46（其中y为电位值，x为氟离子浓度的对数值）。在氟浓度为0.04～1.00 μg/mL线性范围内，该回归方程的相关系数R2=0.9992，表明该标准曲线具有较好的相关性，根据此标准曲线可测定南极磷虾酶解液中的氟浓度。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 醋酸钙添加量对南极磷虾酶解液脱氟率的影响 由图1可知，随着醋酸钙添加量的增加，南极磷虾酶解液脱氟率逐渐上升，添加量为20.0～25.0 mg/mL时达最大值范围，继续添加醋酸钙，脱氟率变化不明显。考虑到成本和实际生产的需要，选择醋酸钙最佳添加量为20.0 mg/mL。

2. 2. 2 初始pH对南极磷虾酶解液脱氟率的影响 如图2所示，当南极磷虾酶解液pH在7.0～10.0范围时，脱氟率由61.25%增至89.76%；酶解液pH超过10.0后，脱氟率略有下降，其中pH在10.0～11.0范围时，脱氟率由89.76%降至84.47%。这是由于醋酸钙属于强碱弱酸盐，当pH>10.0时，Ca2+与OH-形成Ca（OH）2，使Ca2+浓度降低。因此，选择南极磷虾酶解液脱氟反应的最佳初始pH为10.0。

2. 2. 3 反应温度对南极磷虾酶解液脱氟率的影响 由图3可知，南极磷虾酶解液脱氟率随着反应温度的升高呈先升高后降低的变化趋势。反应温度由4 ℃升至30 ℃，脱氟率平缓上升；超过30 ℃后，脱氟率随反应温度的升高持续下降。随温度升高，蛋白质分子的天然构象改变会导致其生物活性丧失，次级键遭到破壞使带电基团也被破坏，其带电性能发生变化可能影响了溶液中的离子反应，从而使脱氟率降低。因此，选择南极磷虾酶解液脱氟工艺的最佳反应温度为30 ℃。

2. 2. 4 反应时间对南极磷虾酶解液脱氟率的影响 如图4所示，随着反应时间的延长，南极磷虾酶解液脱氟率逐渐上升，140 min时脱氟率达最大值，继续反应，脱氟率变化不明显。醋酸钙是强碱弱酸盐，在反应过程中需要一定时间Ca2+才能达到平衡状态，因而CaF2的沉降速度慢，达到最大的脱氟率所需时间较长。考虑到食品工业生产中的效率和能耗等问题，选择酶解液最佳反应时间为140 min。

2. 3 响应面结果分析

2. 3. 1 响应面结果及方差分析 利用Design-Expert 8.0.5对响应面试验结果（表2）进行二次多元回归分析，除去不显著项得到模型的二次多项回归方程为：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2。

由表3可知，模型P<0.0001，而失拟项不显著（P=

0.2213>0.05），表明模型极显著。因素一次项A和B、交互项AC及二次項A2、B2、C2对结果影响极显著（P<0.01），一次项C、交互项AB和BC对结果影响不显著（P>0.05，下同）。同时，软件分析的复相关系数R的R2Adj为97.93%，表明模型中残差相互独立，拟合程度良好，试验误差小，可用于对南极磷虾酶解液的脱氟率进行分析和预测。

2. 3. 2 响应曲面图分析 醋酸钙添加量、初始pH和反应温度3个因素间交互作用对南极磷虾酶解液脱氟率的影响如图6～8所示。反应温度与醋酸钙添加量的交互作用对脱氟率的影响最大，其曲线图最陡峭，随着反应温度的升高和醋酸钙添加量的增加，脱氟率呈先升高后降低的趋势；而初始pH与反应温度、初始pH与醋酸钙添加量间的交互作用对脱氟率的影响不明显，曲线较平滑。响应面分析结果与表3的结果一致。

2. 3. 3 验证试验结果 通过Design-Expert 8.0.5得到二次多项回归方程，在试验因素水平范围内预测南极磷虾酶解液脱氟的最佳工艺条件为：醋酸钙添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反应温度30.24 ℃，此时的酶解液脱氟率理论预测值为85.37%。为检验回归方程预测结果的可靠性，在最优条件下进行3次验证试验，实际测得的脱氟率为（84.15±1.37）%，与理论值的平均误差为1.42%。试验结果充分验证了该模型的正确性，得到的二次多项回归方程可较准确预测醋酸钙法制备南极磷虾酶解液的脱氟率。

2. 4 酶解液中营养物质的变化情况

南极磷虾酶解液在脱氟的过程中其营养成分可能会发生变化，因此以总氮和氨基态氮为指标反映酶解液中营养物质的变化情况，在最佳工艺条件下，检测脱氟反应对南极磷虾酶解液中营养物质的影响。由表4可知，酶解液反应后，其总氮损失3.11%，氨基态氮损失2.52%。利用醋酸钙脱氟对酶解液的营养成分影响不显著，说明脱氟反应对南极磷虾酶解液的主要营养成分影响不明显，醋酸钙法是一种比较理想的脱氟方法。

3 讨论

南极磷虾营养丰富且储量巨大，有广阔的应用前景，但其酶解液中的氟含量过高限制其进一步开发应用。在保留营养物质和原有风味的前提下，将酶解液中过量的氟除去，对于南极磷虾的开发应用具有重要意义。有关南极磷虾的脱氟工艺，已有学者对其进行研究。李红艳等（2011）利用氯化钙脱氟，反应得到酶解液的脱氟率为89.43%。F-和Ca2+形成的CaF2颗粒较小，根据斯托克斯原理，颗粒粒径的平方与微粒的沉降速度呈正比，因此CaF2的沉降速度很慢，达到平衡需较长时间；在反应过程中为了加快反应速率，需加大氯化钙用量，但用氯化钙反应后酶解液有苦涩味，影响南极磷虾酶解液进一步的开发应用。吕传萍等（2012）以生石灰作为钙源，得到酶解液脱氟率为88.25%。生石灰价廉易得，但其溶解度较小，需形成乳浊液才能参与反应。由于F-和Ca2+反应生成的CaF2沉淀会附着在Ca（OH）2颗粒的表面，影响反应速率，因此在反应过程中一般也需加入较多的生石灰。生石灰参与反应释放出大量热，致使蛋白变性，同时使酶解液产生苦涩味和石灰味。本研究以醋酸钙为脱氟剂，采用响应面法优化南极磷虾酶解液脱氟工艺条件，结果发现在最佳条件下酶解液脱氟率为（84.15±1.37）%。虽然与无机钙相比，醋酸钙的脱氟率略低，但醋酸钙作为常用的食品添加剂和营养强化剂，能有效降低酶解液中氟含量，同时对酶解液的风味和营养成分影响较小，是一种理想的脱氟剂，适用于食品工业大规模推广使用。

本研究通过单因素试验和响应面试验对醋酸钙法制备南极磷虾低氟酶解液的工艺条件进行优化，从而建立以醋酸钙添加量（A）、初始pH（B）和反应温度（C）3个因素对南极磷虾酶解液脱氟率（Y）的回归模型：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-

3.20C2。经过验证试验证明，该模型可预测南极磷虾酶解液脱氟率的变化规律，适用于实际生产中的预测。在响应面优化试验中，单因素和双因素交互作用对脱氟率的影响为：醋酸钙添加量、初始pH及醋酸钙添加量与反应温度的交互作用对脱氟率的影响极显著，与吕传萍等（2012）的研究结果不完全一致。优化得出的脱氟工艺条件为：醋酸钙添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反应时间140 min、反应温度30.24 ℃，在此条件下反应后的酶解液营养成分总氮和氨基态氮的含量变化小。在实际生产中采用该工艺参数，可除去酶解液中的过量氟，同时最大限度保留南极磷虾的原有风味和营养成分，有利于南极磷虾酶解液进一步的开发应用，为南极磷虾的食品工业化发展打下基础。

4 结论

采用响应面法优化得到南极磷虾酶解液的最佳脱氟工艺条件为：醋酸钙添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反应时间140 min、反应温度30.24 ℃，在此条件下的脱氟率为（84.15±1.37）%，与理论预测值的相对误差小。该工艺具有操作简单、对酶解液的营养成分影响较小等优点，有较高的可行性；建立的回归模型可用于实际预测。

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（責任編辑 罗 丽）