赵喜亭 朱玉婷 田莹 王昭阳 周颖媛 范子建 蒋丽微 李明军

摘要：【目的】探究番茄不孕病毒（TAV）脱除对怀白菊叶绿素含量和氮代谢水平的影响，为怀白菊脱毒苗的大田推广应用提供理论依据。【方法】以前期获得的TAV脱除怀白菊试管苗为试材，以未经脱除TAV的试管苗为对照（CK），对两者进行继代培养，并测定培养过程中叶片叶绿素含量及氮代谢的相关生理指标。【结果】继代培养过程中，CK与TAV脱除怀白菊试管苗叶片的叶绿素α和叶绿素b含量随培养天数的增加而升高，两者均以继代第22 d时的增幅最大，分别为5.24%和41.69%。与CK相比，TAV脱除提高了相同培养天数时叶片的叶绿素a、叶绿素b含量，且差异达显著（P<0.05，下同）或极显著（P<0.01）水平。怀白菊脱除TAV病毒后，其硝酸还原酶（NR）活力、游离脯氨酸和可溶性蛋白含量在继代培养过程中均显著高于CK，三者最大增幅分别为27.99%（继代22 d）、28.10%（继代22 d）和5.89%（继代38 d）。【结论】TAV脱除能有效提高怀白菊的叶绿素含量及氮代谢水平，利于其生长发育。

关键词： 怀白菊；番茄不孕病毒；脱毒；叶绿素含量；氮代谢

中图分类号： S567.239 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1095-05

0 引言

【研究意义】怀白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai）为菊科（Asteraceae）菊属（Chrysanthemum L.）植物，特指产于古怀庆府（今河南省温县一带）的药菊，因其具有较高的药用价值而备受青睐。怀白菊主要靠扦插、分株等营养方式进行繁殖，长期的营养繁殖使病毒危害严重，引起植株不同程度地花叶、坏死、萎缩等，严重影响其产量和品质。经过本课题组前期对河南省焦作市一带染病怀白菊进行鉴定后发现，其主要感染病毒为番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV），并探明了TAV的结构和全核苷酸序列（Zhao et al.，2015）。TAV是一种RNA病毒，以非持久性的方式由多种蚜虫传播或汁液接种传播，在怀白菊上普遍发生。因此，开展怀白菊TAV病毒脱除及脱除后对其生理生化影响的研究，可为怀白菊脱毒苗的大田推广应用提供理论依据。【前人研究进展】针对病毒危害问题，各种植物脱毒技术应运而生并取得了较好的效果（Wang and Valkonen，2009；栾爱萍，2012；Budiarto，2013）。因怀白菊作为道地药材的特殊性，为保持药材的绿色环保，茎尖结合热处理可作为其脱除病毒的首选方法。本研究室前期已通过茎尖结合热处理脱除了怀白菊的TAV病毒。大量研究表明，植物脱除病毒后，其生理生化特性均会有一定程度的提高，如安徽药菊（薛建平等，2004）、香石竹（王丽花等，2012）脱毒后其叶绿素含量提高，光合速率在一定程度上也随之提高。氮代谢是植物体内一个重要的生理过程，直接影响着植物的产量和品质（张智猛等，2006），甘薯、苹果脱除病毒后，光合能力提高，氮代谢活跃，叶片游离脯氨酸、可溶性蛋白含量增加，硝酸还原酶（NR）活性明显增强（陈选阳等，2001；吴玉霞，2008；周全卢等，2014）。【本研究切入点】本课题组结合怀白菊生产实际从2011年开始致力于病毒调查、鉴定、脱除及病毒脱除后的活性氧代谢与生理生化变化、脱毒苗的大田适应性等方面的研究，明确了TAV是其感染的主要病毒（Zhao et al.，2015），TAV脱除降低了其活性氧代谢水平，增强了其抗氧化能力（赵喜亭等，2015）。但TAV脱除对怀白菊叶片光合作用和氮代谢水平的影响尚不清楚，需进一步探讨。【拟解决的关键问题】以前期获得的TAV脱除怀白菊试管苗为试材，通过对其光合和氮代谢相关指标进行测定，研究继代培养过程中TAV脱除后怀白菊叶片叶绿素a和叶绿素b含量、NR活力、游离脯氨酸和可溶性蛋白含量的变化，旨在探索TAV脱除对怀白菊光合和氮代谢水平的影响，为怀白菊脱毒苗的大田推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料原始植株具有感染病毒的特征，采集于河南科霖达菊珍饮品股份有限公司的怀菊花种植基地，由河南省温县农业科学研究所王天亮高级农艺师进行基原鉴定为怀白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai），之后在绿色药材生物技术河南省工程实验室（河南师范大学生命科学学院）建立无菌试管苗，采用茎尖结合热处理的方法获得茎尖苗，经RT-PCR检测得到脱除TAV的怀白菊试管苗（继代22 d）。

1. 2 试验方法

试验在河南师范大学绿色药材生物技术河南省工程实验室进行。将前期获得的脱除TAV的怀白菊试管苗（Virus-free）及其对照苗（未经脱除TAV的试管苗，CK）在超净工作台上切成带有腋芽的茎段（长约1 cm），接种于1/2 MS+NAA 0.01 mg/L生根培养基中，放入温度为25 ℃、光强3000 lx、光照12 h的培养室中进行继代培养，待培养至第22 d，挑选长势基本一致的组培苗，取顶端完全展开第二、三片叶片测定其叶绿素含量及氮代谢相关指标，每隔8 d测定1次，即第22、30、38、46和54 d进行测定，每个指标测定3个样本，共测定5次。

1. 3 測定项目及方法

叶绿素a和叶绿素b含量采用丙酮乙醇混合液比色法测定（李合生，2000），以丙酮乙醇混合液（体积比为1∶1）为提取液，按叶片∶丙酮（g∶mL）=1∶150比例在黑暗下提取24 h，于645和663 nm下进行比色，按下列公式计算叶绿素含量：

式中，Ca、Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的濃度，A663和A645分别为叶绿素溶液在663和645 nm处的吸光值。

叶绿素含量（mg/g）=叶绿素浓度×提取液总体积×稀释倍数/样品鲜重

NR活力采用离体磺胺比色法测定（李合生，2000）；游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮显色法测定（李合生，2000）；可溶性蛋白含量采用考马斯亮兰染色法测定（赵喜亭等，2011）。

1. 4 统计分析

试验数据采用Excel 2010和SPSS 13.0进行整理及统计分析。

2 结果与分析

2. 1 TAV脱除对怀白菊试管苗叶绿素含量的影响

如图1所示，在继代培养过程中，怀白菊试管苗叶片中叶绿素a和葉绿素b含量变化趋势相同，均随培养天数的增加而升高，且TAV脱除未改变叶片叶绿素含量的变化趋势。与CK相比，相同培养时间点下TAV脱除试管苗叶片的叶绿素a和叶绿素b含量显著（P<0.05，下同）或极显著（P<0.01，下同）升高，两者均以继代培养第22 d时的增幅最大，分别为5.24%和41.69%，与CK差异极显著。

2. 2 TAV脱除对怀白菊试管苗氮代谢相关指标的影响

2. 2. 1 NR活力 由图2可看出，继代培养过程中，CK与TAV脱除试管苗叶片NR活力均随培养天数的增加呈先升高后降低的变化趋势，培养至第46 d时达最大值。TAV脱除试管苗叶片NR活力除在第46 d时显著高于CK外，其他对应培养时间点的NR活力均极显著高于CK，其中在继代22 d时的增幅最大，为27.99%。

2. 2. 2 游离脯氨酸含量 由图3可看出，继代培养过程中， CK与TAV脱除试管苗叶片的游离脯氨酸含量均随培养天数的增加而升高。与CK相比，TAV脱除提高了相同培养天数时叶片的游离脯氨酸含量， 继代培养22、46和54 d时游离脯氨酸含量显著提高，最大增幅为28.10%（继代22 d）。

2. 2. 3 可溶性蛋白含量 由图4可看出，继代培养过程中，CK与TAV脱除试管苗叶片的可溶性蛋白含量均随培养天数的增加而升高。与CK相比，TAV脱除显著提高了与相同培养天数时叶片的可溶性蛋白含量，最大增幅为5.89%（继代38 d）。

3 讨论

叶绿素是与光合作用相关的重要色素分子，参与光能的吸收、传递和转化，在光合作用中扮演重要的角色，其含量的高低在一定程度上可反映植物的光合能力（张国民等，2000）。叶绿素a是光合作用的中心色素分子，叶绿素b是聚光色素。植物感染病毒后，其叶绿体数量及结构会遭到不同程度破坏，导致叶绿素含量降低，进而影响植物光合作用。植物脱除病毒能够降低病毒对其叶绿体数量及结构的伤害，使叶绿素含量有不同程度的提高，如薛建平等（2004）研究发现，安徽药菊脱除病毒后叶绿素含量及净光合速率均有所提高；葛晓霞等（2006）研究表明，脱毒骏枣树叶片叶绿素含量均高于对照，光合速率总体明显高于普通骏枣树，尤其在上午8：00～12：00时平均增高10.7%～

76.6%；王丽花等（2012）研究表明，香石竹经过脱毒处理后其叶绿素a和叶绿素b含量均显著高于非脱毒苗。本研究结果表明，与未进行脱毒的试管苗相比，TAV脱除提高了怀白菊继代培养过程中相同培养天数时叶片的叶绿素a和叶绿素b含量，且差异达显著水平，其中叶绿素b含量最大增幅达41.69%（继代22 d）。表明TAV脱除能够使怀白菊维持较高的叶绿素水平，在相同光照条件下，能够吸收更多光能，有利于提高怀白菊光合能力。

氮代谢是植物体内一个重要的生理过程，包括无机氮的还原、同化及有机含氮化合物转化、合成等过程（Miller and Cramer，2004）。与其相关的生理指标主要有NR活性、游离脯氨酸和可溶性蛋白含量等，这些指标对植物生长均具有重要作用（陈永明等，2014；孙菲菲等，2014；唐秀梅等，2014）。NR可催化植物体内硝酸盐还原为亚硝酸盐，是植物氮同化过程中关键的限速酶，叶片中NR活性的高低控制着整个同化过程，其强弱在一定程度上反映了光合、呼吸及蛋白质合成和氮代谢活性（张智猛等，2006；林丽琳等，2015）。脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，并以游离状态广泛存在于植物体中，是逆境下植物体内氮和能量的贮存库，对植物体内的酶和膜结构有保护作用（陆彬彬，2004）。大多数可溶性蛋白是参加各种代谢的酶类，其含量是植物总体代谢的一个重要指标（宋新颖等，2014）。研究表明，植物脱除病毒能够降低病毒对其自身生理活动的影响，从而提高植物吸收和利用氮的能力，减少硝酸盐的积累，促进氨基酸的合成，进而利于植株的生长，如陈选阳等（2001）研究表明，甘薯脱除病毒后其氮代谢活跃，叶片游离脯氨酸含量增加，硝酸还原酶活性明显增强；吴玉霞（2008）研究发现，在试管苗生长后期，华红、粉红佳人和烟富一号3个苹果品种脱毒苗叶片中的脯氨酸含量、硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量均显著高于普通苗，且差异达极显著水平。本研究结果与上述前人研究结果相似。本研究发现，怀白菊脱除TAV病毒后，其NR活力、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量在继代培养过程中均显著高于非脱毒苗，三者增加最大幅度值分别为27.99%（继代22 d）、28.10%（继代22 d）和5.89%（继代38 d）。脱除TAV的怀白菊硝酸还原酶活性提高，能夠减少硝酸盐在叶片内的积累，降低可溶性氮化合物的积聚，从而促进部分氨基酸与蛋白质的合成。说明TAV脱除使怀白菊在继代培养过程中维持着较高水平的氮代谢。

植物氮代谢与叶绿素含量及光合能力密切相关。光合作用是作物生长最基本的生理过程之一，其生成的同化力和代谢中间产物被氮代谢所利用。氮是叶绿素、蛋白质和酶的重要组成物质，通过对植物叶绿素、光合速率、暗反应的主要酶以及光呼吸等的影响直接或间接影响植物光合作用（尹丽等，2011）。本研究发现TAV的脱除显著增加了相同培养天数时怀白菊叶片的叶绿素a和叶绿素b含量，显著提高了怀白菊的NR活力、游离脯氨酸和可溶性蛋白含量，且叶绿素a、叶绿素b含量增幅最大值出现的时间（继代22 d）和NR活力、游离脯氨酸含量最高增幅出现的时间（继代22 d）相吻合，进一步说明了植物氮代谢与叶绿素含量及光合能力具有相关性，且TAV脱除有利于提高怀白菊的光合能力和氮代谢水平。

为进一步探讨TAV脱除对怀白菊光合及氮代谢的影响，今后还应对TAV脱除对怀白菊叶绿素荧光参数、光合特性参数（如净光合速率、气孔导度等）等指标及NR基因表达等方面进行深入研究。

4 结论

本研究结果表明，TAV脱除能够有效提高怀白菊叶片叶绿素含量及氮代谢水平，利于其生长发育，为怀白菊脱毒苗的大田推广应用打下了基础。

参考文献：

陈选阳，陈凤翔，袁照年，庄宝华，翁定河. 2001. 甘薯脱毒对一些生理指標的影响[J]. 福建农业大学学报，30（4）：449-453.

Chen X Y，Chen F X，Yuan Z N，Zhuang B H，Weng D H. 2001. Effect of virus-elimination on some physiological indices in sweet potato[J]. Journal of Fujian Agricultural University，30（4）：449-453.

陈永明，王行，赵伟才，罗慧红. 2014. 不同烤烟品种成熟期碳氮代谢关键酶活性的变化[J]. 江西农业学报，26（8）：43-45.

Chen Y M，Wang X，Zhao W C，Luo H H. 2014. Changes in activity of key enzymes in carbon-nitrogen metabolism of different flue-cured tobacco varieties at mature stage[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，26（8）：43-45.

葛晓霞，刘和，马晓芳. 2006. 脱毒骏枣幼树叶片叶绿素含量和光合日变化的研究[J]. 山西林业科技，（2）：16-17.

Ge X X，Liu H，Ma X F. 2006. The study on chlorophyll contents and day change of photosynthetic in virus-free young jujube tree[J]. Shanxi Forestry Science and Technology，（2）：16-17.

栾爱萍. 2012. 非洲菊茎尖超低温脱毒及病毒检测技术[D]. 长沙：湖南农业大学.

Luan A P. 2012. Studies on shoot tip virus elimination by cryopreservation and Gerbera Jamesonii virus detection[D]. Ch-

angsha：Hunan Agricultural University.

李合生. 2000. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社：261-263.

Li H S. 2000. Experimental Principle and Technology of Plant Physiology and Biochemistry[M]. Beijing：Higher Education Press：261-263.

林丽琳，陈晟，施木田，吴宇芬，赵依杰，王俊芳，周庆云，彭密红. 2015. Mg 对‘黑美人西瓜叶片 C、 N 代谢的影响[J]. 亚热带农业研究，11（1）：25-30.

Lin L L，Chen S，Shi M T，Wu Y F，Zhao Y J，Wang J F，Zhou Q Y，Peng M H. 2015. Effect of magnesium on carbon and nitrogen metabolism of ‘Heimeiren watermelon leaves[J]. Subtropical Agriculture Research，11（1）：25-30.

陆彬彬. 2004. 低温对水稻幼苗碳氮代谢相关酶的影响[D]. 武汉：武汉大学.

Lu B B. 2004. Effect of low temperature on key enzymes involved in ammonium assimilation and carbon metabolism in rice（Oryza sativa L.） seedlings[D]. Wuhan：Wuhan University.

宋新颖，邬爽，张洪生，林琪，穆平. 2014. 土壤水分胁迫对不同品种冬小麦生理特性的影响[J]. 华北农学报，29（2）：174-180.

Song X Y，Wu S，Zhang H S，Lin Q，Mu P. 2014. Effect of soil water stress on physiological characteristics in different winter wheat cultivars[J]. Acta Agriculturae Boreali Sinica，29（2）：174-180.

孫菲菲，李建刚，王夏，王强，侯喜林. 2014. 不结球白菜氮代谢关键酶在不同氮素条件下的表达分析[J]. 江苏农业学报，30（4）：848-854.

Sun F F，Li J G，Wang X，Wang Q，Hou X L. 2014. Expression analysis of genes encoding enzymes related to nitrogen metabolism in non-heading Chinese cabbage[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Science，30（4）：848-854.

唐秀梅，钟瑞春，揭红科，蒋菁，熊发前，黄志鹏，贺梁琼，李忠，韩柱强，唐荣华. 2014. 间作木薯对花生叶片碳氮代谢产物及关键酶活性的影响[J]. 西南农业学报，27（6）：2316-2321.

Tang X M，Zhong R C，Jie H K，Jiang J，Xiong F Q，Huang Z P，He L Q，Li Z，Han Z Q，Tang R H. 2014. Effect of cassava-peanut intercropping on metabolites and key enzyme activity of carbon-nitrogen metabolism of peanut leaf[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，27（6）：2316-2321.

王丽花，吴学尉，杨秀梅，翟素萍，王继华，莫锡君. 2012. 香石竹斑驳病毒（CarMV）脱除对几种生理指标的影响[J]. 植物生理学报，48（3）：247-250.

Wang L H，Wu X W，Yang X M，Zhai S P，Wang J H，Mo X J. 2012. Production of CarMV-free carnation plants and its effects on some physiological indicators[J]. Plant Physiology Journal，48（3）：247-250.

吴玉霞. 2008. 苹果脱毒试管苗和普通试管苗生理生化特性比较研究[D]. 兰州：甘肃农业大学.

Wu Y X. 2008. Studies on the physiological and biochemical characters of virus-free and common apple in vitro[D]. Lan-

zhou：Gansu Agricultural University.

薛建平，张爱民，盛玮，张国旺. 2004. 安徽药菊脱毒苗与非脱毒苗生理生化的比较研究[J]. 中国中药杂志，29（6）：514-517.

Xue J P，Zhang A M，Sheng W，Zhang G W. 2004. Comparative study on physiological and biochemical mechanism between virus-free seedling and common seedling in Chrysanthemum morrifolium from Anhui[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，29（6）：514-517.

尹麗，胡庭興，刘永安，谢财永，冯毅，颜震，李银华，王永杰. 2011. 施氮量对麻疯树幼苗生长及叶片光合特性的影响[J]. 生态学报，31（17）：4977-4984.

Yin L，Hu T X，Liu Y A，Xie C Y，Feng Y，Yan Z，Li Y H，Wang Y J. 2011. Effect of nitrogen application rate on growth and leaf photosynthetic characteristics of Jatrophacurcas L. seed-

lings[J]. Acta Ecologica Sinica，31（17）：4977-4984.

张国民，王连敏，王立志，宋立泉，张玉华，徐丽梅. 2000. 苗期低温对玉米叶绿素含量及生长发育的影响[J]. 黑龙江农业科学，（1）：10-12.

Zhang G M，Wang L M，Wang L Z，Song L Q，Zhang Y H，Xu L M. 2000. The effect of low temperature on chlorophyll content and growth of maize at seedling stage[J]. Heilongjiang Agricultural Science，（1）：10-12.

张智猛，张威，胡文广，矫岩林，王磊，李伟芳. 2006. 高产花生氮素代谢相关酶活性变化的研究[J]. 花生学报，35（1）：8-12.

Zhang Z M，Zhang W，Hu W G，Jiao Y L，Wang L，Li W F. 2006. Study on enzymatic activity correlative with nitrogen meta-

bolism in high-yield peanut[J]. Journal of Peanut Science，35（1）：8-12.

赵喜亭，宋萍萍，王苗，赵月丽，郭婧，李明军. 2011. 玻璃化超低温保存对怀菊花再生苗形态及生理的影响[J]. 湖北农业科学，50（3）：533-535.

Zhao X T，Song P P，Wang M，Zhao Y L，Guo J，Li M J. 2011. Effect of cryopreservation by vitrification on morphology and physiology of Huaiqing chrysanthemum（Dendranthema morifolium） regeneration plantlets[J]. Hubei Agricultural Sciences，50（3）：533-535.

赵喜亭，田莹，周颖媛，范子建，朱玉婷，蒋丽微，李明军. 2015. 番茄不孕病毒（TAV）脱除对‘怀白菊活性氧代谢的影响[J]. 植物生理学报，51（10）：1757-1763.

Zhao X T，Tian Y，Zhou Y Y，Fan Z J，Zhu Y T，Jiang L W，Li M J. 2015. Effect of TAV-free on active qxygen metabolism of chrysanthemum morifolium‘Huaibai[J]. Plant Physiology Journal，51（10）：1757-1763.

周全卢，张玉娟，黄迎冬，李育明，何素兰，杨洪康，刘莉莎，王梅. 2014. 甘薯病毒病复合体（SPVD）对甘薯产量形成的影响[J]. 江苏农业学报，30（1）：42-46.

Zhou Q L，Zhang Y J，Huang Y D，Li Y M，He S L，Yang H K，Liu L S，Wang M. 2014. Effect of sweet potato virus disease（SPVD） on sweet potato yield formation[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Science，30（1）：42-46.

Budiarto K. 2013. Elimination of Cucumber mosaic virus（CMV）from a range of chrysanthemum cultures through meristem culture following heat treatment[J]. Journal Hamadan Penyakit Tumbuhan Tropika，11（1）：28-34.

Miller A J，Cramer M D. 2004. Root nitrogen acquisition and assimilation[J]. Plant and Soil，274（1）：1-36.

Wang Q，Valkonen J P T. 2009. Cryotherapy of shoot tips：novel pathogen eradication method[J]. Trends in Plant Science，14（3）：119-122.

Zhao X T，Liu X X，Hong B. 2015. Characterization of tomato aspermy virus isolated from chrysanthemum and elucidation of its complete nucleotide sequence[J]. Acta Virologica，59（2）：204-206.

（責任編辑 王 晖）