曾璟，徐明生，沈勇根，吴少福，丁琴（江西农业大学食品科学与工程学院/江西省发展与改革委员会农产品加工与安全控制工程实验室，江西南昌330045）



超声波辅助提取莲子心总黄酮的响应面优化

曾璟，徐明生，沈勇根*，吴少福，丁琴
（江西农业大学食品科学与工程学院/江西省发展与改革委员会农产品加工与安全控制工程实验室，江西南昌330045）

摘要：研究超声波辅助提取莲子心总黄酮的最佳工艺条件。单因素试验考察乙醇体积分数、超声温度、超声功率、料液比、超声时间对总黄酮提取得率的影响，在单因素试验基础上，采用Box-Benhnken响应曲面法考察乙醇体积分数、料液比、超声温度及其交互作用对总黄酮得率的影响。利用软件Design Expert6.0.1对试验数据进行回归分析，得到二次多项式回归方程预测模型。结果表明，莲子心总黄酮的提取工艺最佳条件为乙醇体积分数80%，料液比1∶16（g/mL），超声温度50℃，超声功率120 W，超声时间20min，此条件下总黄酮的提取得率为3.0715%，与预测值基本一致。

关键词：莲子心；超声波；总黄酮；响应曲面；优化

莲子心是睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn）成熟种子中的干燥幼叶和胚芽，《本草纲目》记载其性味苦寒[1-2]，在我国其主要产于浙江、江苏、福建、湖南等地[3]。现代研究表明，莲子心含有生物碱、谷甾醇、挥发油、微量元素、黄酮类化合物等化学成分，具有降血压、抗心律失常、抗血小板聚集、抑制脂质过氧化及清除自由基、抗癌等药理作用[4-6]。同时采用莲子心为原辅料可开发出适用于特定人群食用的具有天然作用的保健食品，其保健作用在《本草纲目》中也有记载，尤其对生物碱的研究较为深入，莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱等为莲子心生物碱的主要活性成分，具有降血压、降血脂、抗氧化、清咽、增强免疫力等保健功能，目前，对莲心保健茶和莲心保健饮料的相关报道较多[7-10]。

莲子心具有悠久的历史，多方面的药用和保健价值，为了进一步开发利用黄酮资源，本文采用响应曲面法优化超声波辅助提取莲子心总黄酮的工艺参数，为莲子心的总黄酮提取工艺提供参考依据，提高莲子心的社会效益和经济效益。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

莲子心：购于江西省广昌县，干燥后粉碎成粉末，过60目筛备用；芦丁对照品：上海试剂三厂；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.2仪器

KQ3200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；723C可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；Anke LxJ-ⅡB低速离心机：上海安亭科学仪器厂；101A-4B型电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；Q-350B3高速多功能粉碎机：上海冰都电器有限公司。

1.3方法

1.3.1芦丁标准曲线的绘制[11]

精密称取干燥后恒重的芦丁对照品0.021 1 g，用体积分数70 %的乙醇溶液溶解并定容100 mL，摇匀，制成质量浓度为0.211 mg/mL的芦丁标准液。分别取上述芦丁标准液0.0，2.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0 mL于25 mL容量瓶中，加入70 %乙醇稀释至10 mL，加入5 % NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min后加入10 % AlNO3溶液1 mL，摇匀，静置6 min后加入NaOH溶液10.0 mL，摇匀后再用体积分数为70 %的乙醇定容至25 mL，摇匀。静置15 min后，以试剂空白作为参比，于510 nm波长下测定其吸光度值，以芦丁标准液浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线（图1）。得线性回归方程为：y=7.573 5x+0.006 2，R2=0.997 6。芦丁含量在0.0168 8 mg/mL～0.084 4 mg/mL内与吸光度（A）呈现良好的线性关系。

图1　芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.2莲子心总黄酮的提取与含量测定

准确称取2 g莲子心粉末，于100 mL三角瓶中，在一定条件下（乙醇浓度、超声温度、超声功率、料液比、提取时间）进行超声提取，提取结束后将提取液进行离心，离心后取1 mL上清液于25 mL容量瓶中，按照标准曲线的方法，测定其吸光度值。根据回归方程得出黄酮浓度，代入公式计算总黄酮得率。

黄酮得率/%=[C×V×N/（W×1 000）]×100（1）

式中：C为稀释后样品中总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；N为提取液稀释倍数；W为莲子心粉末质量，g。

1.3.3单因素试验

为更系统地考察超声波辅助提取的工艺参数，该试验进行了乙醇体积分数、超声温度、超声功率、料液比、超声时间5个因素的单因素试验。方案如下，乙醇体积分数40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 % 6个水平；超声温度25、30、40、50、60、70℃6个水平；超声功率90、105、120、135、150 W 5个水平；料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）6个水平；超声时间10、20、30、40、50、60 min 6个水平。按照1.2.2法提取莲子心总黄酮，并计算得率。

1.3.4响应曲面法优化试验设计

综合单因素试验结果，以莲子心总黄酮提取得率为响应值，选择单因素试验中对响应值有显著影响的因素作为自变量，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计三因素三水平试验方案，运用统计软件Design Expert 6.0.1对试验数据进行回归分析，用模型对超声波辅助提取莲子心总黄酮得率进行分析和预测，得出最佳的提取工艺参数。试验设计因素表见表1。

表1　响应曲面试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1乙醇体积分数对莲子心总黄酮提取得率的影响

分别称取2 g莲子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）分别加入浓度为40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇溶液，在超声功率为120 W，超声温度为30℃，超声处理30 min，研究乙醇体积分数对总黄酮得率的影响见图2。

图2　乙醇体积分数对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由图2可看出，随着乙醇浓度的增大，总黄酮得率也逐渐上升，当乙醇浓度为70 %时，总黄酮得率最大，之后随着乙醇浓度的增大总黄酮得率反而下降。这可能与黄酮类化合物的极性有关，不同体积分数的乙醇极性不同，根据相似相溶原理，莲子心总黄酮的极性可能与70 %的乙醇极性相当，当乙醇体积分数大于70 %时，醇溶性杂质、色素和其它脂溶性成分溶出，这些杂质与黄酮类化合物竞争，导致总黄酮得率下降[12]。

2.1.2超声温度对莲子心总黄酮提取得率的影响

分别称取2 g莲子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）加入体积分数为70 %的乙醇，在超声功率为120 W，温度为25、30、40、50、60、70℃的条件下超声提取30 min，研究超声温度对总黄酮得率的影响见图3。

图3　超声温度对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total flavonoids

由图3可看出，当温度在25℃～30℃时，随着温度的升高，总黄酮提取得率也随着增大，在30℃时，总黄酮提取得率达到最大值，之后，随着温度的不断升高，总黄酮提取得率反而逐渐下降。其原因可能是随着温度的升高，分子运动加快，黄酮类化合物易溶于溶剂当中，过高的温度使提取液中黄酮类成分或水解或裂解而被破坏，且杂质的溶出量增加[13]，导致总黄酮提取量下降。

2.1.3超声功率对莲子心总黄酮提取得率的影响

分别称取2 g莲子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）加入体积分数为70 %的乙醇，在超声功率为90、105、 120、135、150 W，超声温度为30℃的条件下超声提取30 min，研究超声功率对总黄酮得率的影响见图4。

图4　超声功率对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids

由图4可看出，随着超声功率的增大，总黄酮提取得率也随之增大，当超声功率达到120 W时，总黄酮提取得率最大，之后随着超声功率的增大，总黄酮提取得率反而急剧下降。与汪明珠等[14]在响应曲面优化女贞子总黄酮的超声波提取工艺中的结果一致。其原因可能是增大超声功率，细胞破碎程度也更大，黄酮类化合物溶出量随之增大，但是过大的超声功率，热效应产生的高温使部分黄酮类物质被裂解或破坏[15]，导致总黄酮提取得率下降。

2.1.4料液比对莲子心总黄酮提取得率的影响

分别称取2 g莲子心粉末，按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）加入体积分数为70 %的乙醇，在超声功率为120 W，超声温度为30℃的条件下超声提取30 min，研究料液比对总黄酮得率的影响见图5。

图5　料液比对黄酮得率的影响Fig.5 Effec of solid to liquid ratio on the yield of total flavonoids

由图5可看出，当料液比小于1∶20（g/mL）时，料液比越大，总黄酮提取得率也越大，当料液比大于1∶20（g/mL）时，随着料液比的增大，总黄酮得率逐渐减小。与张俊生等[16]在超声波辅助乙醇提取莲子心总黄酮及其抗氧化活性的研究结果一致。分析其原因，可能是由于随着溶剂的增大，莲子心与乙醇溶剂之间的接触面及浓度差也增加，提高了黄酮类物质向溶剂中转移的扩散系数，使得总黄酮提取率增大，当料液比超过1∶20（g/mL）时，溶剂量增多，过多的溶剂会对超声波产生一定的吸收作用[17]，使得黄酮得率下降。

2.1.5超声时间对莲子心总黄酮提取得率的影响

分别称取2 g莲子心粉末，按料液比1∶20（g/mL）加入体积分数为70 %的乙醇，在超声功率为120 W，超声温度为30℃，分别超声提取10、20、30、40、50、60 min，研究超声时间对总黄酮得率的影响见图6。

图6　超声时间对黄酮得率的影响Fig.6 Effec of ultrasonic treatment time on the yield of total flavonoids

由图6可看出，当超声时间为10 min～20 min时，随着超声时间的加长，总黄酮提取得率也随着增大，20 min时达到最大值，之后，随着超声时间的加长，总黄酮提取得率则逐渐缓慢降低。分析其原因可能是随着时间的延长，样品中黏液质等杂质进入浸提液，使浸提液黏度增大，扩散速度变慢，导致黄酮类化合物不易溶出[18]。

2.2响应曲面法对莲子心总黄酮的超声波提取的优化结果

2.2.1响应曲面试验优化设计结果

综合单因素试验结果，选取对总黄酮得率影响较大的因素：乙醇体积分数、料液比、超声温度为主要考察因素，以莲子心总黄酮得率为响应值，进行响应曲面优化试验，结果见表2。

表2　Box-Behnken响应曲面试验设计及实验结果Table 2 Experiment design and results of Box-Behnken response surface

续表2 Box-Behnken响应曲面试验设计及试验结果Continue table 2 Experiment design and results of Box-Behnken response surface

2.2.2拟合回归模型方程的建立

运用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到响应曲面二次多元回归模型方程：

y赞=23.519 18-0.383 85A-0.090 457B-0.429 45C+ 1.613 07×10-3A2+ 5.317 30×10-3B2+ 1.844 58×10-3C2-6.880 00×10-4AB+5.081 25×10-3AC-2.720 00×10-3BC

2.2.3试验结果的方差显著性分析

对回归模型进行方差分析（表3）。

从表3可以看出：P模型=0.025 6＜0.05，表明该模型显著。失拟项P=0.5735＞0.05，模型失拟项不显著。模型的决定系数R2=0.8601，说明该模型能解释86.01 %响应值变化，拟合程度良好，试验误差较小，可以用此模型对超声波辅助提取莲子心总黄酮得率各因素对其的影响进行分析和预测。

由表3可知，方程一次项A对总黄酮得率有显著影响，其余各项对结果影响不显著，由F值可知，A、B、C三个因素对总黄酮得率影响的主次顺序为A>C>B；方程二次项对总黄酮得率均不显著；交互项AC对总黄酮得率有极显著影响，交互项AB、BC对结果影响不显著。由此表明各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。采用逐步回归分析的方法在剔除了不显著项后得到真实值的优化回归方程为：

y赞=13.901 70-0.171 78A-0.034 725B-0.336 29C+ 5.081 25AC，P模型=0.002 3＜0.01，表明模型极其显著。失拟项P=0.520 2＞0.05，模型失拟度不显著。说明该拟合回归模型方程与实际情况拟合良好，较好的反应了乙醇体积分数、料液比、超声温度对总黄酮提取得率的影响。

2.2.4两因素显著交互作用对总黄酮提取得率的影响

乙醇体积分数（A）与超声温度（C）的交互作用，图7是料液比为1∶20（g/mL）时，乙醇体积分数与超声温度的交互作用对莲子心总黄酮提取得率的响应曲面图及其等高线图。随着乙醇体积分数和超声温度的增大，总黄酮提取得率从开始的无明显变化到逐渐增大。当乙醇体积分数在75 %～80 %，超声温度在45℃～50℃时总黄酮提取得率最大。

图7　乙醇浓度体积分数与超声温度的交互作用对总黄酮得率的影响Fig.7 Effect of ethanol valume fraction and ultrasonic temperature interaction on the yield of total flavanoids

2.2.5最佳工艺条件的预测与验证

利用得到的回归方程，通过Design-Expert 6.0.1软件计算可知，莲子心总黄酮提取的最佳工艺参数为：乙醇浓度79.80 %，料液比1∶15.94（g/mL），超声温度49.97℃，超声功率120 W，超声时间20 min，此条件下模型预测的总黄酮提取得率的最大值为3.097 88 %。考虑到试验操作的可行性，将最佳工艺条件修正为乙醇浓度80 %，料液比1∶16（g/mL），超声温度50℃，超声功率120 W，超声时间20 min，在此最优条件下做3次验证试验，得到的总黄酮提取得率为3.0715 %，两者相对误差为0.86 %，说明建立的数学模型可靠性较好，响应曲面优化莲子心总黄酮提取的工艺条件可行。

3　结论

单因素试验中，乙醇体积分数为60 %～80 %时提取效果较好；超声温度为30℃～50℃时提取效果较好；料液比为1∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）时提取效果较好；超声功率为120 W时提取效果最佳；超声时间为20 min最佳。采用响应曲面法对超声波辅助提取莲子心总黄酮的工艺参数进行优化，对乙醇体积分数、料液比、超声温度三个主要影响因素在三个不同水平上进行试验。利用回归方程，得到莲子心总黄酮提取的最优工艺参数为：乙醇浓度80 %，料液比1∶16（g/mL），超声温度50℃，超声功率120 W，超声时间20 min，此条件下实际测得总黄酮的提取得率为3.0715%。

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Ultrasound-assisted Extraction of Total Flavonoids from Lotus Plumule with Response Surface Methodology

ZENG Jing，XU Ming-sheng，SHEN Yong-gen*，WU Shao-fu，DING qin
（Engineering Laboratory for Agro-processing and Safety Control of Jiangxi Development and Reform Commission，College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，Jiangxi，China）

Abstract：The study aimed at optimizing the condition for extraction of total flavonoids from lotus plumule by means of unrasonic-assisted technique. The effects of ethanol valume fraction，ultrasonic temperature，ultrasonic power，solid-liquid ratio，ultrasonic time on the yield of total flavonoid were discussed in the single factor experiment. Based on the single factor experiment，effects of ethanol valume fraction，solid-liquid ratio，ultrasonic temperature and their interactions on the yield of total flavonoid were analyised by Box-Benhnken response method. The predictive model of polynomial regression equation was analysed by Design Expert software （6.0.1）. The result showed that the optimum extraction of total flavonoids from lotus seed core were：ethanol valume fraction 80 %，solid-liquid ratio 1∶16（g/mL），ultrasonic temperature 50℃，ultrasonic power 120 W，ultrasonic time 20 min，under this conditions the extraction of total flavonoids was 3.071 5 %，consistent with the predicted values.

Key words：lotus plumule；ultrasonic；total flavonoid；response surface；optimization

收稿日期：2015-02-01

*通信作者：沈勇根（1971—），男，教授，硕士，研究方向：食品科学与工程。

作者简介：曾璟（1992—），女（汉），硕士生，研究方向：食品工程。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.031