帅智峰　韩翠翠　张晓杰

【摘要】 目的：利用微流控芯片平台探索肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）影响人胃癌SGC7901细胞对化疗药物的耐药及其与GRP78表达的相关性，从而为临床工作提供以CAFs和GRP78为靶点来改善肿瘤耐药的新思路。方法：本实验自主设计了一个可用于药敏检测及蛋白半定量的三维联合共培养微流控芯片体系，通过灌注细胞悬液-凝胶混合物于三维培养池内来实现胃癌细胞系的三维培养。应用凋亡染色方法检测SGC7901细胞单独培养组（对照组）、SGC7901细胞+NFs共培养组、SGC7901细胞+CAFs共培养组中SGC7901细胞对不同浓度的化疗药物顺铂的药物敏感情况。应用免疫荧光法检测对照组和实验组SGC7901细胞GRP78表达。结果：SGC7901细胞+CAFs共培养组与单培养组相比，SGC7901细胞对顺铂的敏感性较SGC7901细胞单独培养时低（P<0.05），SGC7901细胞+CAFs共培养组SGC7901细胞中GRP78蛋白表达较对照组升高（P<0.05）。结论：CAFs可以诱导人胃癌SGC7901细胞对顺铂耐药；CAFs可能通过上调人胃癌SGC7901细胞中GRP78的表达而导致耐药。

【关键词】 微流控芯片； 肿瘤相关成纤维细胞； 胃癌； 耐药

The Relevance of CAFs Influencing the Drug Resistant of Gastric Cancer Cells and the GRP-78 Expression Based on Microfluidic Chip/SHUAI Zhi-feng，HAN Cui-cui，ZHANG Xiao-jie.//Medical Innovation of China，2016，13（09）：005-008

【Abstract】 Objective：The platform of microfluidic chip is used to explore the relevance of cancer-associated fibroblasts（CAFs） influencing the resisitence of human gastric cancer SGC7901 cells to chemotherapy drugs and the expression of GRP-78，to provide the new idea that CAFs and GRP78 as targets improve tumor drug resistance for clinical work.Method：A microfluidic chip system of three-dimensional co-culture was designed independently which could be used for drug sensitive detection and protein semi-quantitative in this experiment.Three-dimensional culture of gastric cancer cell line was achieved by perfusing cell suspension-gel mixture.Apoptosis staining was applied to detect the sensitivity of SGC7901 cells to chemotherapeutic drugs cisplatin with different concentrations in separate culture group of SGC7901 cells（the control group），co-culture group of SGC7901 cells and NFs，co-culture group of SGC7901 cells and CAFs.The expressions of GRP78 in the control group and experimental group were detected by immunofluorescent assay.Result：Compared with the control group，the sensitivity of human gastric cancer SGC7901 cells to cisplatin in the co-culture group of SGC7901 cells and CAFs was obviously lower than that in the control group（P<0.05）.Compared with the control group，the GRP78 expressions of SGC7901 cells in the co-culture group of SGC7901 cells and CAFs was distinctly higher（P<0.05）.Conclusion：CAFs can induce the drug resistance of SGC7901 cells to cisplatin； CAFs may lead to drug resistance by up-regulating the GRP78 expression in human gastric cancer SGC7901 cells.

【Key words】 Microfluidic chip； Cancer-associated fibroblasts； Gastric cancer； Drug resistance

First-authors address：Basic Medical College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.002

胃癌是我国最常见和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1-2]，严重影响人们的生命和健康。化疗是治疗进展期和转移性胃癌的主要方法，但现应用5-FU、顺铂和紫杉醇为基础的各种联合化疗方案的总体有效率只有20%～40%，肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性常常导致化疗失败[3-4]。已有研究发现，CAFs在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等过程中均起到了重要作用，并可能与肿瘤的耐药性相关[5-6]。微流控芯片是一种在微米尺度空间对流体进行操纵为主要特征的科学技术，由于芯片中流体通道直径与细胞生长所需空间相适宜，通过连续动态供养、多种细胞的三维共培养，使细胞生长环境更加类似于其在体内的真实生长状态[7]。因此，本研究拟通过微流控芯片平台进行CAFs、NFs和胃癌细胞共培养，来探索CAFs影响胃癌细胞对化疗药物的耐药及其与GRP78表达的相关性，从而为临床工作提供以CAFs和GRP78为靶点来改善肿瘤耐药的新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系 人胃癌细胞系SGC7901细胞，为齐齐哈尔医学院医药科学研究院提供。

1.1.2 新鲜组织获取 人新鲜胃癌组织来源于本院附属医院肿瘤外科，人包皮新鲜组织来源于本院附属医院泌尿外科，均由术中获取，获取前经患者或家属知情同意和本单位伦理委员会许可。

1.1.3 主要试剂 优质胎牛血清、碘化丙碇（PI）染色剂、羊抗人GRP78抗体、鼠抗人平滑肌肌动蛋白抗体SMA和鼠抗人β-actin抗体均购自Sigma公司；FITC标记荧光二抗、辣根酶IgG抗体、蛋白提取剂试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒均购自碧云天公司；基底膜提取物（BME）购自R&D Systems公司；RPMI1640和IMDM基础培养液购自hyclone公司；顺铂购自Aladdin公司。

1.2 方法

1.2.1 微流控芯片的构建与处理 本课题组设计了微流控芯片CAD图形，并交于大连海事大学基于标准软光刻技术制作SU-8负胶模板。此设计用于药敏检测及蛋白半定量的三维联合共培养微流控芯片体系，通过灌注细胞悬液-凝胶混合物于三维培养池内来实现胃癌细胞系的三维培养；通过中部连接通道上的二维培养单元来实现成CAFs、NFs与胃癌细胞的非接触式共培养；并通过微型注射泵持续注入实现流动实时营养物供给，使细胞所处的环境更加接近体内肿瘤微环境，以便模拟人体内肿瘤的真实状况。主要方法：于模板上制作PDMS基片，等离子清洗活化PDMS基片和玻璃载玻片，使之相互键合，完成芯片制备过程。使用前，向芯片的进液孔注入无水乙醇并使之充满整个通道，然后用蒸馏水冲洗乙醇，操作3次，将芯片于高压蒸汽锅内高压灭菌，烘箱中烘干，紫外消毒后使用。微流控芯片及局部结构示意图见图1。

1.2.2 实验分组 实验分单培养组（对照组）和共培养组（实验组）。对照组为单培养组（胃癌细胞系SGC7901细胞），共培养组分为SGC7901细胞+CAFs共培养组、SGC7901细胞+NFs共培养组。

1.2.3 药敏检测 三组芯片中各实验组细胞培养48 h后，通过MS26微量泵经芯片药物入口将顺铂泵入芯片，将芯片置于孵箱内诱导48 h。PBS注入芯片，冲洗细胞后向芯片中注入PI染液，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.4 耐药相关蛋白表达 三组芯片中各实验组细胞培养48 h后，免疫荧光检测各实验组细胞中GRP78蛋白的表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂药物敏感性的检测 为了验证CAFs对肿瘤细胞药物敏感性的影响，笔者把各实验组细胞用顺铂作用48 h，PI染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。SGC7901细胞+CAFs共培养组与单培养组相比，SGC7901细胞对顺铂的敏感性较SGC7901细胞单独培养时低（P<0.05），见图2。

2.2 GRP78蛋白表达的检测 为了验证CAFs和SGC7901细胞共培养后对SGC7901细胞中GRP78蛋白表达的影响，以及探讨GRP78的表达与CAFs引起的肿瘤细胞对顺铂耐药的相关性，用芯片平台免疫荧光法检测SGC7901细胞GRP78蛋白表达水平。SGC7901细胞+CAFs共培养组SGC7901细胞中GRP78蛋白表达较对照组升高（P<0.05），见图3。

3 讨论

胃癌的发病率占消化系统肿瘤的第一位，是我国死亡率最高的恶性肿瘤之一。早期胃癌主要通过手术治疗，而晚期和转移性胃癌主要依靠化疗，但胃癌的耐药现象往往导致胃癌化疗失败，因此探讨胃癌耐药机制成为一项重要的研究课题[7-8]。

以往的大量体外实验研究证实，许多化疗药物均能显著诱导胃癌细胞系发生凋亡，但这一结果在内体研究时往往效果并不明显，因为体内肿瘤微环境要远比体外单一的实验环境复杂得多，尤其是肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）可能参与了胃癌细胞的耐药过程[9]。

本课题组构建了微流控芯片细胞三维共培养平台实现肿瘤相关成纤维细胞与胃癌细胞的非接触共培养，探讨CAFs对胃癌细胞耐药性的影响。微流控芯片技术构建的实验室具有微型化、高通量、集成化的优势，能实现肿瘤细胞的三维动态培养。利用微流控芯片将肿瘤细胞和间质细胞进行共培养，芯片通道与细胞大小相适应，模拟了细胞在体内生长所需的空间；利用微量泵给细胞提供流动培养基，并带走代谢废物，更加真实地模拟肿瘤在体内的生存状态，构建了体内肿瘤微环境，是进行肿瘤相关研究的理想模式。

肿瘤间质相关成纤维细胞（CAFs）与创伤修复过程中的成纤维细胞不同，不再向正常表型转化，而保持持续活化的特征，并通过产生各种细胞因子促进临近肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，促进肿瘤的演进。CAFs和肿瘤细胞之间的相互作用表现在许多方面，它还可能与肿瘤细胞的耐药性有关，而以往对肿瘤耐药性的研究多侧重于肿瘤细胞本身，但越来越多的研究者发现肿瘤间质成分可能通过各种途径影响肿瘤细胞的耐药性。为了验证CAFs对肿瘤细胞药物敏感性的影响，笔者把各实验组细胞用顺铂作用48 h，PI染色后显微镜下细胞凋亡情况。结果显示CAFs+SGC7901共培养组与单培养组相比，SGC7901细胞对顺铂的敏感性较SGC7901细胞单独培养时低（P<0.05），表明CAFs能降低顺铂对胃癌细胞的敏感性，促进SGC7901细胞对顺铂的耐药。此前有研究者发现CAFs与抗血管生成药的耐药性的产生有关，能引起肿瘤细胞对西妥昔单抗的耐药[10-11]。

CAFs可能通过代谢调节、免疫调节等途径促进肿瘤细胞的耐药。肿瘤细胞由于增殖速度快，必然导致营养相对供应不足，造成局部低氧和酸中毒的微环境，可诱导葡萄糖调节蛋白（Glucose regulated proteins，GRPs）的产生[12]，其中GRP78是这种应激性蛋白的代表。它是一种内质网分子伴侣蛋白，许多研究报道GRP78高表达与某些肿瘤细胞耐药相关[13-15]。本研究用微流控芯片平台免疫荧光法检测SGC7901细胞GRP78蛋白表达水平，探讨CAFs引起的胃癌细胞对顺铂的耐药是否能引起与GRP78蛋白表达的改变。结果CAFs与SGC7901细胞共培养组SGC7901细胞中GRP78蛋白表达较对照组升高（P<0.05），因此推断，CAFs引起的SGC7901细胞对顺铂耐药与GRP78蛋白的表达有一定相关性。

综上所述，肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中最主要的宿主细胞，肿瘤微环境中的CAFs可能通过增加肿瘤细胞中GRP78蛋白的表达而引起胃癌细胞对顺铂的耐药，微流控芯片构建的肿瘤细胞成纤维细胞共培养体系能真实模拟体内肿瘤微环境，是研究肿瘤的理想模式。

参考文献

[1]周凯凯，张建文，黄仁峰，等.117例胃体癌手术切除方式分析[J].中国医学创新，2014，11（1）：3-5.

[2]刘海荣，李岩.Stathmin与胃肠道肿瘤关系的研究进展[J].中国医学创新，2014，11（1）：154-156.

[3] Hundahl S A，Philips J L，Menck H R.The National Cancer Data Base Report on poor survival of U.S.gastric carcinoma patients treated with gastrectomy：Fifth Edition American Joint Committee on cancer staging，proximal disease，and the“different disease”hypothesis[J].Cancer，2000，88（4）：921-932.

[4]雷辉.糖尿病胃轻瘫发病机制及治疗方法分析[J].中国医学创新，2014，11（1）：152-154.

[5] Dvorak H F，Weaver V M，Tlsty T D，et al.Tumor microenvironment and progression[J].J Surg Oncol，2011，103（6）：468-474.

[6]袁锡裕，叶根榕，黎曙练，等.胃肠手术后血清白蛋白浓度的影响与预测因素[J].中国医学创新，2014，11（3）：21-23.

[7] Bauer M，Su G，Beebe D J，et al.3D microchannel co-culture：method and biological validation[J].Integr Biol，2010，2（7-8）：371-378.

[8]李燕威.ICU危重患者预后与早期胃肠营养干预的相关性分析[J].中国医学创新，2014，11（3）：52-53.

[9]许家本，苏文源，张宝红.荆花胃康胶丸加标准三联疗法治疗糜烂型胃炎的疗效观察[J].中国医学创新，2014，11（3）：86-88.

[10] Johansson A C，Ansell A，Jerhammar F，et al.Cancer-associated fibroblasts induce matrix metalloproteinase-mediated cetuximab resistance in head and neck squamous cell carcinoma cells[J].Mol Cancer Res，2012，10（9）：1158-1168.

[11]程国宝.奥美拉唑治疗80例返流性食管炎临床疗效观察[J].中国医学创新，2014，11（4）：102-103.

[12] Gazit G，Hung G，Chen X，et al.Use of the glucose-starvation inducible glucose-regulated protein 78 promoter in suicide gene therapy of murine fibrosarcoma[J].Cancer Res，1999，59（13）：3100-3106.

[13] Su S F，Chang Y W，Andreu-Vieyra C，et al.miR-30d，miR-181a and miR-199a-5p cooperatively suppress the endoplasmic reticulum chaperone and signaling regulator GRP78 in cancer[J].Oncogene，2013，32（39）：4694-4701.

[14]Wey S，Luo B，Tseng C C，et al.Inducible knockout of GRP78/BiP in the hematopoietic system suppresses Pten-null leukemogenesis and AKT oncogenic signaling[J].Blood，2012，119（3）：817-825.

[15]华关民，唐荣德，梁剑宁，等.血清CRP与hs-CRP检测值比较与相关性分析[J].中国医学创新，2014，11（3）：32-34.

（收稿日期：2015-12-09） （本文编辑：欧丽）