蔡守平,何学友，曾丽琼，苏文晶，黄金水

(1.福建省林业科学研究院，国家林业局南方山地用材林培育重点实验室，福建 福州 350012；

2. 泉州市森林病虫防治检疫站，福建 泉州 362000)



绿僵菌在木麻黄林间宿存动态的初步研究

蔡守平1,何学友1，曾丽琼1，苏文晶2，黄金水1

(1.福建省林业科学研究院，国家林业局南方山地用材林培育重点实验室，福建 福州 350012；

2. 泉州市森林病虫防治检疫站，福建 泉州 362000)

摘要通过测定木麻黄林间土壤中、菌条上的绿僵菌孢子的宿存数量及萌发率，研究绿僵菌在木麻黄林中的宿存动态。结果表明：绿僵菌孢子引入木麻黄林间土壤中，45 d内孢子数量迅速下降；45 d时土壤中的绿僵菌孢子数不足初始带菌量的30%，其后孢子数量呈持续缓慢下降或维持在一个相对稳定的水平。绿僵菌菌条绑缚在木麻黄树干上后，其上的孢子迅速下降，至30 d时，菌条孢子量仅为初始值的30%左右，随后呈现持续缓慢下降的趋势。土壤中的孢子萌发率可始终保持在一个较高水平，而菌条上孢子的萌发率变化较为复杂。

关键词孢子；菌条；萌发率；绿僵菌；宿存

木麻黄林是我国东南沿海沙地防护林的主要组成部分，在抵御风沙危害、改善生态环境中发挥了突出作用。但由于沿海生态条件较为恶劣、造林种质资源良莠不齐等因素，木麻黄害虫时有发生，影响了木麻黄林的防护效益[1，2]。笔者所在的课题组在利用绿僵菌等虫生真菌生物防治木麻黄林主要害虫方面取得了一些进展[3-7]。绿僵菌不仅可以在昆虫体上营寄生生活，还能在土壤中兼性腐生，保持自身的存活状态，在森林生态系统中维持种群数量，从而起到持续防控害虫的作用[8]。因此，研究绿僵菌在生态系中的宿存情况，可为更好地利用其持续、有效地控制害虫提供理论依据。近年一些研究分析了绿僵菌在土壤中宿存数量的动态变化[9-13]。本文通过对土壤中、菌条上的绿僵菌孢子在木麻黄林间的宿存数量及萌发率变化的研究，以期揭示绿僵菌在木麻黄林生态系统中的宿存情况。

1材料与方法

1.1供试菌剂

供试菌剂生产菌株均为金龟子绿僵菌MetarhiziumanisopliaeMaZPTR-01，为福建省林业科学研究院森林保护研究所分离、保存。

绿僵菌孢子粉制作：绿僵菌孢子粉由福建省林科院森保所实验室生产，生产方法为液-固双相发酵法，绿僵菌菌株经液体发酵后，接种于麦麸、米粉、玉米粉和谷壳(体积比为1∶1∶1∶3)组成的固体培养基中，接种量为15%(V/W)，然后置于浅盘中进行固体发酵，培养室温度控制在25±2 ℃，湿度90%以上，产孢后经自然风干，用振动筛(200目)进行筛分，得到孢子粉，置于4 ℃保存备用，经测定，孢子粉含量为400亿孢子g-1。

绿僵菌菌条制作：制作方法参见徐金柱等[14]方法。绿僵菌菌株经液体发酵后，接种于培养载体(市售土工布裁剪的布条)上，布条规格为40 cm×5 cm。菌条产孢完经干燥后，置于4 ℃低温条件下保存。经测定，绿僵菌菌条含孢量为4.4×108孢子cm-2，孢子萌发率>99%。

1.2试验地概况

试验点在福建省惠安赤湖国有防护林场大山头工区，该工区位于24°54′ N，118°54′ E，海拔15 m，年均降水量为1 033 mm，年均气温19.8 ℃。主要林分为木麻黄纯林，有少量木麻黄与桉树(Eucalyptusspp.)、相思树(Acaciaspp.)等混交林，林龄在30 a以上，郁闭度大于0.8。

1.3绿僵菌在木麻黄林间的宿存动态

1.3.1绿僵菌孢子在林间土壤中的宿存2015年5月底，从上述试验地林间取沙土，带回实验室过筛，去除树根、草根、大石子等杂物，取少量孢子粉与筛过的沙土均匀混合。经测定，最终土壤带菌量约为5×107孢子g-1。然后将混合好的带菌沙土回填入林间准备好的带孔塑料框中，使框中土面与地表齐平，并轻轻覆盖木麻黄枯枝等地被物(作为1个取样点)。取样：分别于施菌后15、30、45、60、90、120、150、180、210 d进行取样，取样时轻轻拨开塑料框上的地被物，用土壤取样器在每一个点垂直打孔取样(打孔深度30 cm)，将每个取样点的3个样点的土样混匀，带回实验室测定含孢量与孢子萌发率。共设置3个取样小区，每个小区间隔100 m以上，每个小区设置3个取样点(3个重复)。

孢子量测定(参考何学友等研究方法[15])：土样取回后，加入适量灭过菌的0.05%吐温80溶液，用高速振荡器使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，然后在显微镜下用血球计数板计数，换算成含孢量。

孢子萌发率测定：将上述孢子悬浮液，滴在涂有SDAY培养基的载玻片上，25 ℃恒温培养箱中保湿培养，20 h后，用3%的甲醛溶液固定，显微镜下统计发芽率，每样5次重复，以发芽率计为活孢率。

1.3.2菌条上孢子在树干上的宿存将上述制作好的绿僵菌菌条轻轻绑缚于木麻黄树干基部50 cm处一圈，菌条用多根铁钉固定。定期(与土壤取样时间一致)随机剪取宽度为1～2 cm的小方块，设置3个取样点，每个取样点每次取3个菌条小块，带回实验室后放入烧杯内，加入一定量的0.05%吐温80溶液，高速振荡器充分振荡使孢子分散。然后用血球计数板计数，最后换算成单位面积的孢子含量。

孢子萌发率测定同1.3.1。

2结果与分析

2.1绿僵菌孢子在木麻黄林土壤中的宿存

绿僵菌孢子引入木麻黄林间土壤后其孢子数量宿存情况见图1。从图1中可以看出，在最初的45 d内孢子数量快速下降，随后持续缓慢下降或维持或下降到一定程度后恢复。施菌45 d后，土壤中的绿僵菌孢子数为1.32×107孢子g-1，不足初始带菌量的30%(4.85×107孢子g-1)，而后孢子数量下降速度减缓，至210 d时，土壤中孢子数量维持在0.64×107孢子g-1。

绿僵菌孢子在木麻黄林土壤宿存过程中萌发率变化见图2。从图2中可以看出，试验期间土壤中绿僵菌孢子萌发率总体维持在较高的水平，除210 d时孢子萌发率为91.5%，显著低于其他时间的孢子萌发率以外，其他时间孢子萌发率基本维持在95%以上，可见土壤中宿存的孢子活力维持较好。

2.2绿僵菌菌条上孢子在木麻黄林中的宿存

绿僵菌菌条绑缚在木麻黄树干上后，其上的孢子量变化情况见图3。从图3中可以看出，菌条绑缚在树干上后，其上的孢子迅速下降，15 d时菌条上的孢子量为初始值的1/2左右，至30 d时，菌条上平均1.51×108孢子cm-2，仅为初始值的30%左右。45 d时孢子量少量回升，之后呈缓慢下降的趋势，至210 d时，菌条上的孢子量平均仅为0.4×108孢子cm-2，不足初始值的1/10，菌条表面基本看不到孢子的存在，仅在靠树干面的菌条还有少量孢子可见。

菌条上孢子萌发率情况见图4。从图4中可以看出，菌条上的孢子萌发率变化较土壤中复杂，萌发率整体呈逐渐下降的趋势，不同时间菌条上孢子萌发率差异显著，至180 d和210 d时，菌条上孢子萌发率低于90%，而其他时间段孢子萌发率基本维持在90%以上。

3结论与讨论

木麻黄是东南沿海防护林的主要造林树种，但沿海地区环境特殊，土壤主要是以沙土为主，且沿海地区风大，绿僵菌在木麻黄林中的宿存能力对木麻黄主要害虫的持续控制作用具有重要意义。本研究发现绿僵菌孢子引入木麻黄林土壤中，45 d内绿僵菌孢子量迅速下降，其后进入一个平稳期，甚至在某些时间段，孢子量还有少量回升，说明绿僵菌孢子在土壤中成功定殖，并维持在一个相对稳定的水平，这对保持林间的带菌量具有重要作用。其他学者研究也发现，绿僵菌施用后的一段时间内，在适应新环境中各种可能的不利因素中宿存量或者存活力出现明显下降，但仍能维持一定的存活性保证其土壤延续[12]。陈斌等研究发现绿僵菌KMa0107菌株在未灭菌土和灭菌土中的半衰期分别为17和23 d，第56天分生孢子的CFU下降率达到80%[13]；樊美珍等报道混在土中的分生孢子和菌丝有一部分在13 d内即迅速丧失活力，在62 d后各处理的CFU都降低80%以上[9]，程子路等研究不同绿僵菌菌株在土壤中的宿存动态，也发现在前30 d各种绿僵菌成菌落数下降速度较快，均达到或接近半数，其后成波动状态，自第3个月起，成菌落数快速降低，最终维持在1 000～10 000 CFUg-1土壤的水平[11]。李兴佳等以 Real-Time PCR 方法和平板稀释法，分别对花生根部施用金龟子绿僵菌后不同时期的土壤进行定量分析，结果表明，施用的金龟子绿僵菌在花生田间呈现先快速下降后缓慢回升的趋势，90 d时金龟子绿僵菌DNA 量和CFU值均下降至初始的 10%以下，之后出现回升[16]。本研究中绿僵菌在木麻黄林土壤中的宿存趋势与这些研究基本类似。

目前，关于绿僵菌菌条上的孢子在林间宿存情况还未见相关报道。本研究中发现绿僵菌在45 d内孢子量迅速下降，可能是由于菌条绑缚于林间后，受到风、雨、其他生物活动等因素造成孢子从菌条上掉落；而后孢子量有一个小幅回升，这可能是由于菌条培养基质(土工布吸附)中仍有一些营养成分，在林间环境湿度较大时，培养基质吸水，使得孢子又可利用其营养再次萌发生长，从而导致孢子量小幅回升，但这种作用有限，随后孢子量仍逐渐减少。

从孢子萌发率上来看，菌条暴露在空气中，其水分、温度、光照尤其是紫外线等因素复杂，对其孢子活力影响较大，而土壤环境(湿度、温度、紫外线等)较空气中变化小，所以土壤中的孢子萌发率可始终保持在一个较高水平，而菌条上的孢子萌发率变化较为复杂。何学友等在研究林间地表松墨天牛僵虫体上的孢子宿存动态也发现绿僵菌孢子在126 d内平均萌发率保持在90%以上[15]。

本研究中关于绿僵菌的计数方法是采用直接计数法，主要是因为绿僵菌孢子形态特殊(长椭圆形)，在显微镜下易于观察。其他学者在相关研究中主要采用CFU法，笔者也曾尝试使用该方法，但采用相关报道中的选择性培养基，未取得理想的分离效果。李兴佳等采用Real-Time PCR法，研究了绿僵菌孢子在花生田间土壤中的宿存情况，取得了理想的效果[16]，用分子手段测定绿僵菌的宿存动态结果较为可靠与准确，也是未来发展的方向，关于这方面研究有待进一步深入。

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Survival Dynamics ofMetarhiziumanisopliaeinCasuarinaequisetifoliaForest

Cai Shouping1,He Xueyou1,Zeng Liqiong1,Su Wenjing2,Huang Jinshui1

(1. The Key Laboratory of Timber Forest Breeding and Cultivation for Mountainous Areas in Southern China,Fujian Academy of Forestry, Fuzhou, 350012，China;2. Forest Pest Control and Quarantine Station of Quanzhou City, Quanzhou 362000, China)

AbstractThe survival dynamics of Metarhizium anisopliae in Casuarina equisetifolia forest were studied through determining CFU and germination rate of spores for Metarhizium anisopliae in fungal band and soil in Casuarina equisetifolia plantation. Result shows that the spores of M. anisopliae were declined very quickly during 45 days after the spores were introduced into the soil. The number of spores is only 30% of the initial number after 45 days. Then the spores decline slowly. Spores on fungal band decline to 30% of the initial number after 30 days, then the spores continue to slowly drop. The germination rate of spores in the soil maintains at a high level during the testing period, while that on fungal band varied complicatedly.

Key wordsspores;fungal band;germination rate; Metarhizium anisopliae ;survival dynamic

中图分类号：S476.1

文献标识码：A

doi:10.13601/j.issn.1005-5215.2016.04.006

作者简介：蔡守平(1981-)，男，安徽广德人，硕士，高级工程师，现从事森林害虫生物防治研究，Email: caishouping@163.com

基金项目：福建省自然基金项目(2014J01096)；福建省省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1011-2)

收稿日期：2016-02-26

文章编号：1005-5215(2016)04-0023-04