杨丽芬，杨建，高玲玲,3，郭建伟,2，洪亮，程加省，孔琼，田学军

（1.红河学院云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自 661100；2.中国科学院新疆生态与地理研究所干旱区生物地理与生物资源重点实验室，乌鲁木齐 830011；3.河南省农业科学院农副产品加工研究所,郑州 450002；4.云南省农业科学院粮食作物研究所/国家小麦改良中心云南分中心，昆明 650205）



三七疫霉病拮抗根际土壤细菌的筛选及初步鉴定

杨丽芬1，杨建1，高玲玲1,3，郭建伟1,2，洪亮1，程加省4，孔琼1，田学军1

（1.红河学院云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自 661100；2.中国科学院新疆生态与地理研究所干旱区生物地理与生物资源重点实验室，乌鲁木齐 830011；3.河南省农业科学院农副产品加工研究所,郑州 450002；4.云南省农业科学院粮食作物研究所/国家小麦改良中心云南分中心，昆明 650205）

摘 要：为了筛选对环境友好的生防细菌防治三七疫霉病，通过高温处理、稀释涂布法分别从三七健康及患病植株根际土壤分离了21和16株可培养细菌，并以对峙培养法分别筛选到6和7株拮抗菌株，上述13株拮抗菌株经生理生化特征鉴定为芽孢杆菌属。结果表明，健康植株根际土壤有较丰富的可培养细菌，而患病植株根际土壤可培养细菌中的拮抗菌株较丰富，表明健康植株与患病植株根际土壤的拮抗细菌丰度发生了变化。解淀粉芽孢杆菌B1的抑菌带宽达8.5mm，具有一定的潜在生防价值。

关键词：恶疫霉; 根际细菌; 拮抗作用

三七[Panax notoginsing (Burk) F.H.Chen]是伞形目五加科人参属多年生草本植物，别名田七、山漆、人参三七、血山草、六月淋、蝎子草等，喜温暖阴湿环境；[1-3]原产于云南文山，目前已多年未见野生三七，栽培种主要种植在云南文山（据文山州生物资源开发与三七产业办估计，2012年文山州三七种植面积约15.47万亩）、红河（据红河州生物产业办保守估计，2012年红河州三七种植面积约12.46万亩）及广西、广东、福建、江西等地.三七具有散瘀止血、消肿止痛的功能，主治咯血、吐血、便血、崩漏、外伤出血、跌扑肿痛、胸腹刺痛等，[4]成为我国重要的名贵中药材.

据王勇等[5]报道，1952年三七疫病发现于浙江，1994年戚佩坤等[6]报道了广东南雄的三七疫病，均将病原菌鉴定为恶疫霉[Phytophthora cactorum (Leb.et Cohn) Schroter]；云南省在1959年、1987年均发现三七疫病，2007年从云南文山州文山县、马关县不同海拔地区的7个样地分离的病原菌均为恶疫霉(P.cactorum).该病害为系统性侵染病害，可以危害茎、叶、根和种子，其发病主要相关因子为温度、湿度、透光率、地形、轮作年限、氮肥等.[7]

1993年Utkhede的研究表明，枯草芽孢杆菌对由恶疫霉引起的苹果根腐病具有显著的抑制作用.[8]此外，芽孢杆菌属、金黄杆菌属、假单胞菌属等多株土壤或植物内生菌显著抑制辣椒疫霉病等病害.[9-15]目前，刘志强等报道三七根系土壤中的芽孢杆菌对三七根腐病具有较好的拮抗效果及稳定性[16].因而，本研究旨在从三七根际土壤分离耐高温细菌并筛选拮抗菌株，为三七疫霉病的生物防治提供潜在的应用菌株.

1　材料与方法

1.1 材料

供试三七疫病病原菌恶疫霉(P.cactorum) PHC01、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) BAA01由红河学院云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室提供，分离自文山州三七病茎；供试健康和患病三七各4株根基土（30g-50g），由张成元于2012年8月按照抖土法[17]采自文山州砚山县.

病原菌活化及三七根际土壤细菌分离、生理生化特征分析所用PDA培养基、LB培养基、硝酸盐还原实验培养基、淀粉水解实验培养基、酪蛋白水解实验培养基等均参照东秀珠等，[18]页码其中对峙培养法筛选拮抗菌株所用PDA培养基中加10g蛋白胨[19]页码.

1.2 耐高温根际土壤细菌的分离

将健康、患病三七根际土壤样品分别混合成一份，磨碎、混匀、过筛（100目），每份样品取10g细土样放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，转速120r/min、25℃恒温震荡1d，使土样与水充分混匀，再用80℃水浴30min以杀死微生物菌体和其他杂菌保留芽孢.[20]热处理后静置5min，吸取1mL土壤悬液加入盛有9 mL无菌水的大试管中充分混匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同稀释度的土壤溶液[18].取各梯度土壤悬液30μL涂布于LB平板，每个梯度3个重复，置于32℃恒温培养箱中培养48 h.依据菌落质地、颜色、边缘是否整齐、中央是否凸起等挑取不同形态的菌落进行稀释涂布分离单菌落，保存备用.[18]

1.3 拮抗性菌株的初筛与拮抗测定

在加有蛋白胨的PDA平板接种病原菌，以四点接种法接种获得菌株，即以平板中心为圆心以30mm为半径每隔90°角的圆周线上放置相同孔径的无菌滤纸，每个滤纸片点接一个菌株5μL菌液，以点接5μL无菌水为对照，每个处理3个重复，28℃恒温培养5-14d，观测是否抑制病原菌的生长，并测量抑菌带大小.

1.4 拮抗细菌的形态及部分生理生化测定

参照东秀珠等方法[18]、并以解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)BAA01为参照菌对拮抗菌株进行革兰氏染色、淀粉水解、接触酶反应、硝酸盐还原等基本的形态学与生理生化测定.

2　结果与分析

2.1 三七根际土壤耐高温细菌的分离

经80℃恒温处理30min的土样，从健康植株根际土样5个梯度的稀释涂布LB平板共分离、纯化21个细菌菌株；从患病植株根际土样分离、纯化16个细菌菌株，共计获得37株细菌.结果表明，健康植株根际土样的可培养细菌多样性更为丰富，这或许是由于健康植株根系分泌的化合物较为丰富、理化性质稳定，根际细菌类群、数量也相对稳定，均易于分离；而患病植株根系经病原真菌入侵分解产生较多植物组织碎片，具备降解三七根系组织碎片功能的根际细菌相对更容易获得营养形成优势种群，导致其他类群的细菌较难分离.

2.2 拮抗三七疫霉病菌株的筛选

采用对峙培养法，从健康植株根际土样细菌筛选出拮抗性菌株6个（H3、H5、H8、H9、H10、H11），占该样品分离菌株的28.6%；从患病根际土样细菌筛选出拮抗菌株7个(B1、B3、B4、B5、B6、B7、B8)，占分离菌株的33.3%.总计获得拮抗菌株13个，占总菌株数的35.1%，另有64.9%的细菌功能尚不明确.各拮抗菌株对病原菌的抑菌带宽如表1、图1所示，其中菌株B1拮抗效果最好，抑菌带宽达8.5mm.

表1　13株三七疫病拮抗菌的抑菌带宽及生理生化特征Tab.1 Inhibition zone width,physiological and biochemical characteristics and of antagonistic strains against P.cactorum

图1　根际土壤细菌与病原菌PHC01的对峙培养Fig.1 Confrontation culture between rhizobacteria and pathogen PHC01.

2.3 拮抗性菌株的鉴定

结合《常见细菌鉴定手册》经形态学及生理生化特征等初步鉴定，B8属于枯草芽孢杆菌，其余12株属于解淀粉芽孢杆菌.

3　讨论

三七为多年生喜阴凉、潮湿的植物，三年及以上种植园的疫霉病、根腐病、细菌性青枯病、灰霉病等发病较为严重，环形凹地的疫霉病发病率高达50%以上[7,21].吴照祥等[17]利用T-RFLP和Biolog两种免培养技术研究患根腐病三七田的根际土壤真菌，结果表明健康植株和患病植株的根际土壤真菌群落多样性无显著差异，但两者间某些真菌种类的丰度发生了变化，患病植株根际土壤真菌数量减少；林茂兹等（2012）[22]、杨尚东等（2013）[23]的研究表明，连作作物或患病作物的根际土壤细菌数量减少.本研究利用稀释涂布法和对峙培养法对比研究了健康植株、患病植株根际土壤可培养细菌和疫霉病拮抗细菌的多样性，结果表明健康植株根际细菌较丰富，但疫霉病拮抗菌株比例低.这或许是感染疫霉病的三七田内健康植株和患病植株根际土壤细菌的多样性并未发生显著性改变，只是可培养细菌某些类群的丰度发生了变化，从而导致健康植株根际土壤中群落组成相对均衡的可培养细菌更易于分离，而患病植株根际土壤可培养细菌中的疫霉病拮抗菌株更易分离.

本研究筛选的13株拮抗细菌经生理生化鉴定，12株属于解淀粉芽孢杆菌、1株属于枯草芽孢杆菌，这与辣椒等植物疫霉病拮抗内生及土壤细菌常常筛选到解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等芽孢杆菌是相符的[9,13,15].解淀粉芽孢杆菌B1抑菌带宽达8.5mm，既具有高拮抗性又具有可抗逆境的芽孢，便于开发抗逆性强、耐贮存的生防菌剂，因而均具有较好的应用前景.

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[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:11.

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[责任编辑 鲁海菊]

Screening and Preliminarily Identification of Rhizosphere Soil bacterial Controlling Phytophthora Cactorum of Panax Notoginsing

YANG Li-fen1,YANG Jian1,GAO Ling-ling1,3,GUO Jian-wei,HONG Liang1,CHENG Jia-sheng4
(1.Key Laboratory of Higher Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province,Honghe University,Mengzi 661100,P.R.China; 2.Key Laboratory of Biogeography and Bioresource in Arid Land,Institute of Ecology and Geography,Chinese Academy of Sciences,Urumqi 830011,China; 3.Institute of Agricultural Products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,P.R.China; 4.Food Crops Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences/National Wheat Improvement Center Yunnan Branch,Kunming 650205,China)

Abstract:To screen eco-friendly bio-control bacteria controlling Phytophthora cactorum of Panax notoginsing,21 and 16 strains rhizobacteria were separated respectively from healthy and infected Panax notoginsing by thermal processing,tissue crashing method,dilution coating method,additionally 6 and 7 strains antagonistic bacteria among them were respectively selected by confrontation culture method,then total of antagonistic bacteria above were identified as Bacillium spp.through physiological and biochemical characteristics.The results suggested that there were richer cultural bacteria in rhizosphere soil of healthy plants,in contrast that there were relatively richer antagonistic bacteria in rhizosphere soil of infected plants.In another word,the richness of antagonistic bacteria changed in rhizosphere soil of healthy and infected plants.Bacillus amyloliquefaciens B1 identified by physiological and biochemical characteristics,which had a certain potential bio-control value because of inhibition zone width up to 8.5 mm.

Key words:Phytophthora cactorum; Rhizobacteria; antagonism

通讯作者：郭建伟（1979-）男，河南兰考人，博士，讲师，研究方向：农作物病害防治及经济管理。

作者简介：杨丽芬（1986-），女，云南宣威人，硕士，助教，研究方向：农作物病害防治及经济管理研究

基金项目：红河学院硕士点植物保护一级学科建设项目; 红河学院中青年学术骨干人才计划项目（2015GG0206）

收稿日期：2015-06-26

DOI:10.13963/j.cnki.hhuxb.2016.02.007

中图分类号：Q939

文献标识码：A

文章编号：1008-9128（2016）02-0024-03