张建锋，刘 文，吴增光，张石宇，王钰乐，杨道斌

（贵阳中医学院，贵州贵阳550002）

黔产吴茱萸的UPLC－MS／MS指纹图谱分析

张建锋，刘 文＊，吴增光，张石宇，王钰乐，杨道斌

（贵阳中医学院，贵州贵阳550002）

为了对吴茱萸的质量控制、研究开发和应用提供科学依据，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1．7μm，100mm×2．1mm），以水（A，含0．05%甲酸）－乙腈（B）为流动相，梯度洗脱；柱温40℃，流速0．4mL／min，进样量2μL，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）对其进行相似度评价。结果：建立了吴茱萸UPLC－MS／MS指纹图谱的共有模式，确定了27个共有峰，并根据对照品和参考文献指认了11个共有峰，对20批不同产地和品种的吴茱萸药材相似度进行分析，其相似度在0．90以上。结论：首次建立了吴茱萸药材UPLC－MS／MS指纹图谱分析方法，该分析方法快速、灵敏、简便，可为吴茱萸药材各品种的质量控制提供依据。

吴茱萸；UPLC－MS／MS；指纹图谱；质量控制；聚类分析

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，主产于贵州、广西、湖南、云南等省区，具有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻的功效［12］。近年来，吴茱萸新的药理作用、化学成分和利用新指标控制其提取纯化工艺已得到深入研究［36］。黔产吴茱萸一直以来被认为是吴茱萸的道地药材，且产量大品质好，药效稳定，为临床常用药。吴茱萸由于生长环境、气候条件等因素影响，其物质基础存有差异。指纹图谱分析方法作为控制吴茱萸药材的质量方法之一，目前在吴茱萸研究过程中已有应用［7－9］，但有关UPLC－MS／MS方法对黔产吴茱萸化学成分进行定性分析研究尚无报道。因此，笔者应用UPLC－MS／MS联用技术对黔产吴茱萸进行研究，为吴茱萸药材的质量控制提供参考。

1材料与方法

1．1试验材料

1．1．1仪器及试剂CQUITY UPLC（美国Waters公司），质谱检测器（Waters－Xevo TQ），MassL－ynx TM质谱工作站软件（Waters公司），科导SK8210HP型台式超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），Auy220型电子天平（日本岛津）。乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），甲酸（色谱纯，CNW公司），屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司），0．22μm微孔滤膜（广州泛宏贸易有限公司），吴茱萸碱（Evodiamine）对照品（中国食品药品检定研究院，110802—201409），吴茱萸次碱（Rutecarpine）（中国食品药品检定研究院，110801—201207）；吴茱萸内酯（Limonin）（中国食品药品检定研究院，110800—201205），乙腈、甲酸为色谱醇，水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1．1．2吴茱萸及其来源 吴茱萸［Euodia rutaecarpa（Juss．）Benth．］分别来自贵州省印江县（S1）、石阡县（S2）、松桃县（S3）、思南县（S4）、玉屏县（S5）、榕江县（S6）、德江县（S7）、江口县（S8）和黔西县（S9），疏毛吴茱萸［Euodia rutaecarpa（Juss．）］分别来自贵州省威宁县（S10）、金沙县（S11）、大方县（S12）、万江县（S13）、德江县（S14）、石阡县（S15）和绥阳县（S16），石虎［Euodia rutaecarpa（Juss．）Benth．var．bodinieri（Dode）Huang］分别来自贵州省石阡县（S17）、沿河县（S18）、思南县（S19）和天柱县（S20）。不同产地及品种吴茱萸样品经贵阳中医学院周汉华教授鉴定为正品。

1．2溶液制备

1）对照品溶液的制备：精密称取吴茱萸次碱、吴茱萸碱、柠檬苦素对照品适量，用100%甲醇溶解并稀释制成0．662g／L、0．512g／L和0．204g／L的对照品储备液。

2）样品溶液的制备：取样品粉末（过3号筛）约0．2g，精密称定，置锥形瓶中，加入100%甲醇50mL，浸泡1h，超声处理30min，放冷，摇匀，用微孔滤膜（0．22μm）滤过，备用。

1．3色谱与质谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（1．7 μm，100mm×2．1mm），柱温40℃，样品温度10℃，流速0．4mL／min，进样量2μL；以含0．05%甲酸的水（A）－乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（表1）。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution program

离子源为ESI源，正离子扫描模式，毛细管电压3．0kV，取样锥孔电压30V，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流量600L／h，锥孔气流量50L／h。

1．4提取条件的选择

分别以25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、90%甲醇、甲醇、乙醇、水作为提取溶剂，以微波提取、加热回流提取、超声提取作为提取方法，以30min、45min、60min、90min、120min作为提取时间，经UPLC－MS／MS检测，把色谱峰数、峰面积、分离度、基线、峰形等因素作为指标，选择最佳提取溶剂、提取方法和提取时间。经比较，最佳提取方案为以甲醇为提取溶剂、超声波作为提取方法，提取时间30min。

1．5色谱和质谱条件优化

比较水－乙腈、0．05%甲酸水－乙腈、0．10%甲酸水－乙腈、0．20%甲酸水－乙腈、0．50%甲酸水－乙腈、1．00%甲酸水－乙腈、0．10%甲酸水－0．10%甲酸乙腈、水－甲醇、0．10%甲酸水－甲醇、0．10%甲酸水－0．10%甲酸甲醇等流动相系统的色谱峰峰形，以0．05%甲酸水－乙腈系统得到的色谱峰峰形较好且稳定。比较0．35mL／min、0．40mL／min、0．45mL／min、0．50mL／min的流速，以0．40mL／min的最佳；比较0．5μL、1．0μL、2．0μL、5．0μL的进样量，以2．0μL的进样量色谱峰峰形较好，各成分分离较好；比较100～1 000和200～800质荷比，以100～1 000范围内色谱峰数相对较多，信息量丰富，响应值高。

2结果与分析

2．1方法学考察

精密度实验试验测得各共有峰相对保留时间RSD＜2．74%，相对峰面积RSD＜3．03%，表明进样和仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求（RSD＜5．0%）。重复性试验测得共有峰相对保留时间RSD＜3．12%，相对峰面积RSD＜2．24%，表明方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求（RSD＜5．0%）。稳定性试验测得各共有峰相对保留时间RSD＜2．62%，相对峰面积RSD＜3．23%，表明样品溶液在24h内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求（RSD＜5．0%）。

2．2指纹图谱及标定

2．2．1指纹图谱20批不同产地的吴茱萸药材UPLC－MS／MS指纹图谱见图1，根据色谱峰中各色谱峰的相对保留时间，选取其中27个共有峰作为特征指纹峰，建立了吴茱萸样品的对照指纹图谱（图2）。

2．2．2指纹图谱的标定 比较20批供试品的色谱图，确定27个共有峰，选择保留时间适中且与相邻色谱峰分离良好，峰面积比较稳定的吴茱萸碱（10号峰）作为参照峰，计算各指纹峰保留时间和峰面积与同一图谱中参照峰的保留时间和峰面积比值，得到相对保留时间（表2）和相对峰面积（表3）。

2．3不同来源吴茱萸药材相似度评价

从20批吴茱萸的相似度（表4）可知，各样品与对照谱相比，其相似度均达0．9，表明药材质量稳定，差异较小。

2．4聚类结果

聚类分析是根据相似程度大小把样品分类，目前广泛应用于中药的真伪鉴别、质量评价、产地加工、品种分类等方面。对20个产地的吴茱萸药材进行指纹图谱分析，得到包括吴茱萸碱（10号峰）的27个共有色谱峰，将各个共有峰相对于参比峰的峰面积量化，得到20×27阶数据矩阵，导入SPSS 16．0版软件，采用组间连接法，选用欧氏距离对20批药材进行聚类分析结果（图3）表明，20个产地的吴茱萸药材分为两类，来自贵州铜仁、黔东南等产地的药材即样品S1～S9和S13～S15聚为第1类，说明这12个产地的吴茱萸药材指纹图谱较为相似；其他8个产地的药材聚为第2类，即样品S10～S12和S16～S20。吴茱萸和疏毛吴茱萸虽然品种不一，但具有一定的相似性；同为疏毛吴茱萸但存有一定差异性，可能与气候条件、地质条件、栽培条件等方面有关。

图1 吴茱萸20批样品的指纹图谱Fig．1 Fingerprint of 20 E．fructus samples

图2 吴茱萸样品的对照指纹图谱Fig．2 CK fingerprints of E．fructus samples

2．5指纹图谱共有峰的UPLC－MS结构鉴定及各成分

对27个共有峰中的11个主要峰的结构进行鉴定，其中3个色谱峰与对照品比较，通过对保留时间、一级质谱与二级质谱信息与对照品一致，鉴定为吴茱萸内酯（8号峰）、吴茱萸碱（10号峰）、吴茱萸次碱（11号峰）。其他结构成分见表5。

表2 吴茱萸药材指纹图谱共有峰相对保留时间Table 2 Relative retention time of common peaks in fingerprint of 20 Euodiae Fructus samples

表3 吴茱萸药材指纹图谱共有峰相对峰面积Table 3 Relative peak area of common peaks in fingerprint of 20 E．Fructus samples

表4 不同批次吴茱萸药材样品相似度Table 4 Similarity among 20 Euodiae Fructus samples

图3 20批吴茱萸药材的聚类树状图Fig．3 Cluster analysis of 20 E．Fructus samples

表5 吴茱萸质谱数据和相关成分的化学鉴定Table 5 Mass spectrometric data and relative chemical components of E．Fructus

3结论与讨论

试验首次建立了黔产吴茱萸UPLC－MS／MS指纹图谱，该图谱信息量丰富、出峰数目多、分离效果好，全面反映了黔产吴茱萸化学成分的信息，符合中药指纹图谱的技术要求，结合相似度计算和聚类分析对指纹图谱进行综合评价，使得结果科学、可靠、准确、全面，为吴茱萸药材的质量评价提供了参考。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典［S］．北京：中国医药科技出版社，2010：160．

［2］康廷国．中药鉴定学［M］．北京：中国中医药出版社，2005：316－317．

［3］Zhao N，Li Z L，Li D H，et al．Quinolone and indole alkaloids from the fruits of Euodia rutaecarpa and their cytotoxicity against two human cancer cell lines［J］．Phytochemistry，2015，109：133－139．

［4］Hu C Q，Li K K，Yang X W．New glycosidic alkaloid from the nearly ripe fruits of Euodia rutaecarpa［J］．Journal of Asian Natural Products Research，2012，14（7）：634－639．

［5］Huang X，Zhang Y B，Yang X W．Indoloquinazoline alkaloids from Euodia rutaecarpa and their cytotoxic activities［J］．Journal of Asian Natural Products Research，2011，13（11）：977－983．

［6］王 群，刘 文，宋信莉，等．多指标优化吴茱萸的提取纯化工艺［J］．中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：45－48．

［7］张红梅，李 国，宋 龙，等．贵州和浙江产吴茱萸指纹图谱分析及含量测定［J］．中国实验方剂学杂志，2014，20（17）：69－73．

［8］袁清照，张水寒，李顺祥，等．吴茱萸道地药材的高效液相指纹图谱研究［J］．中草药，2010，41（9）：1534－1538．

［9］赵 平，许海玉，许 浚，等．吴茱萸药材的HPLC指纹图谱研究［J］．中国中药杂志，2010，35（23）：3178－3183．

［10］邱时祎．吴茱萸中生物碱的分离纯化与质谱特征［D］．上海：华东理工大学，2012．

（责任编辑：聂克艳）

《贵州农业科学》常用法定计量单位及其符号

加工贮藏·农产品质量

Processing and Storage·Agricultural Product Quality

Fingerprint Analysis of Euodiae fructus by UPLC－MS／MS

ZHANG Jianfeng，LiIU Wen＊，WU Zengguang，ZHANG Shiyu，WANG Yule，YANG Daobin
（1．Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou550002，China）

The similarity of 20 E．fructus samples from different producing areas was evaluated by the evaluation system of fingerprint similarity in traditional Chinese medicine（2004A）under the test conditions of ACQUITY UPLC BEH C18chromatographic column（1．7μm，100mm×2．1mm），mobile phase of water with 0．05%methanoic acid（A）－acetonitrile（B）for gradient elution，40℃，0．4mL／min flow velocity and 2μL injection volume to provide the scientific basis for quality control，research，development and application of E．fructus．Results：The common model of E．fructus UPLC－MS／MS fingerprint is established and 27common peaks are determined．11common peaks are identified according to the reference substance and reference list．The similarity of 20 E．fructus samples from different producing areas is above 0．90．In conclusion，the PLC－MS／MS fingerprint analysis method with rapidity，high sensitivity and simplicity can be used in quality control of E．fructus medicinal materials．

Euodiae fructus；UPLC－MS／MS；fingerprint；quality control；clustering analysis

S567

A

1001－3601（2016）02－0084－0137－06

2015－08－05；2016－02－05修回

国家自然科学基金资助项目“基于‘谱效’关联的戊己胃内漂浮释药系统制备工艺环节评价研究”（81460609）

张建锋（1981－），男，在读硕士，研究方向：中药新技术与新制剂。E－mail：286911082＠qq．com

＊通讯作者：刘 文（1968－），男，教授，硕士生导师，从事中药新技术与新制剂研究。E－mail：642771631＠qq．com