唐红波 张彤 陶晓军 杜博 冯欣 张其清

100006北京，首都医科大学附属北京妇产医院药事部（唐红波、冯欣）；300192天津,中国医学科学院 北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室（唐红波、张彤、陶晓军、杜博、张其清）

乙酰普鲁兰纳米粒子与牛血清白蛋白的相互作用

唐红波 张彤 陶晓军 杜博 冯欣 张其清

100006北京，首都医科大学附属北京妇产医院药事部（唐红波、冯欣）；300192天津,中国医学科学院 北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室（唐红波、张彤、陶晓军、杜博、张其清）

目的 考查乙酰普鲁兰纳米粒子（PANs）与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，为研究PANs体内药代动力学特征奠定基础。 方法 将不同浓度的PANs溶液和BSA溶液混合，应用荧光法和圆二色谱（CD）法考察二者间的相互作用，计算PANs与BSA结合的缔合常数（Kq），观测PANs-BSA抗尿素变性的作用。结果 PANs对BSA荧光的影响具有浓度相关性，PANs溶液（0.015～0.25 mg/ml）与BSA（0.25 mg/ml）的缔合常数Kq从2.64×104增高至3.55×105；在尿素或加热条件下，PANs-BSA溶液和BSA溶液的CD光谱具有相似的变化趋势。结论 PANs对BSA的荧光光谱具有显著影响，但PANs未影响尿素和高温对BSA的变性作用。

乙酰普鲁兰； 牛血清白蛋白； 纳米粒子； 荧光光谱； 圆二色谱

0 引 言

在药物递送系统（Drug delivery systems）研究中，纳米粒子进入血液循环后，表面立即被多种蛋白尤其血清白蛋白覆盖，形成蛋白“corona”[1]。蛋白在纳米粒子表面吸附并形成“corona”状结构不仅对蛋白结构和功能有影响，反之，表面吸附的蛋白对纳米粒子的尺寸、形状、表面电荷、表面结构、聚集态等物理性质变化起着至关重要的作用[2]，进而影响纳米粒子包括药物纳米晶和载体体内毒性、药物释放、药代动力学以及临床有效性。因此，研究纳米粒子与蛋白的相互作用在药物递送系统研究中具有极其重要的意义。

天然多糖，包括壳聚糖、普鲁兰、纤维素以及淀粉等，作为具有良好生物相容性的可降解高分子材料，在药物控/缓释制剂研究中占有重要地位。近几年，由于普鲁兰多糖具有生物相容性、低毒性及易功能化修饰性，在多糖类药物载体研究中逐渐成为研究热点[3-4]。研究表明，将胆甾醇疏水改性后的普鲁兰纳米粒子与人血清白蛋白共孵育发现，载体的疏水性及表面电荷对纳米粒子-蛋白复合物的形成起着决定性作用。二者相互作用不仅影响蛋白的二级结构，使白蛋白α螺旋减少，同时，蛋白的吸附延缓了药物释放[5]。本课题组前期对普鲁兰多糖进行了乙酰化疏水改性及叶酸修饰，合成了乙酰普鲁兰纳米粒子（pullulan acetate nanoparticles,PANs）并对其进行了表阿霉素负载，考察了普鲁兰基纳米药物体外稳定性、靶向性、药代动力学及生物分布[6-8]。由于不同疏水改性、粒径、表面电荷等理化性质均与白蛋白吸附密切相关，本研究主要考察PANs与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的相互作用，揭示乙酰化普鲁兰（pullulan acetate，PA）类载体对蛋白结构、功能及蛋白对纳米粒子物理性质的影响，为相关纳米药物体内生物分布及药效、药物代谢动力学研究提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

普鲁兰多糖（平均分子质量为2×105u，医药级）（日本Hayashibara公司），BSA（6.67×104u，电泳级）（天津联星生物技术有限公司），聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）（美国Sigma-Aldrich公司），其他试剂均为市售分析纯。

VarioSkan Flash全波长多功能读数仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），Avanti J-25低温离心机（美国Beckman Coulter公司），J-815圆二色谱仪（circular dichroism spectrometer,CDS）（日本 Jasco公司）。

1.2 方法

1.2.1 PANs的制备

按照课题组前期方法[8]制备PANs。将100 mg PA溶于10 ml二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述溶液滴加入体积分数为0.5%的PVA溶液中；4℃条件下18 000 r/min低温离心15 min，收集PANs；用去离子水进行分散，探头超声处理3 min（输出功率为100 W，采用间歇脉冲工作方式：脉冲宽度为2.0 s，间歇时间为2.0 s），将PANs稀释至实验所需浓度。

1.2.2 PANs-BSA复合物的制备

将一定质量浓度的PANs溶液（0～2 mg/ml）和BSA溶液（0.5 mg/ml）混合并稀释至一定浓度，在室温下避光孵育2 h，即得PANs-BSA复合物。

利用荧光分光光度计检测复合物的荧光光谱，激发波长为295 nm，扫描范围为300～460 nm（激发和发射单色器的狭缝宽度分别为2.5、5.0 nm），进一步确定PANs和BSA的缔合情况。

1.2.3 荧光法检测PANs和BSA之间的虚拟缔合常数

将 0.5 ml系列质量浓度的 PANs溶液（0～0.25 mg/ml）和0.5 ml BSA溶液（0.25 mg/ml）混合并稀释至2.0 ml，在室温下避光放置4 h；然后对混合物进行荧光扫描，激发波长为295 nm，扫描范围为300～460 nm，并检测 342 nm处的发射强度，对PANs的质量浓度作图，并按以下公式计算PANs和BSA之间的虚拟缔合常数Kq[9]

式中：[Q]为纳米粒子溶液的摩尔浓度，I0和I分别为BSA加入PANs前后的荧光强度。

1.2.4 圆二色谱法检测PANs-BSA复合物性质

用CDS记录PANs-BSA复合物的远紫外圆二色谱（circular dichroism，CD）图，扫描范围为200～300 nm，石英池光程为1 cm。各参数设定如下：分辨率为0.2 nm，扫描速率为100 nm/min，狭缝宽度为1nm，响应时间为1s，灵敏度为20mdeg。记录结果为3次扫描的平均值，BSA的质量浓度为0.5 mg/ml。

将一定量的蛋白变性剂尿素溶液（2、4、6、8、10 mmol/ml）加入BSA溶液或PANs-BSA混悬液，用CDS检测222 nm处的平均椭圆度，并对尿素浓度作曲线，考察PANs对抗变性剂的情况。

按同样方法制备PANs-BSA复合物，研究复合物中BSA的热稳定性，从20℃升温至100℃，以0.75℃/min的速度加热样品，记录222 nm处平均椭圆度的变化。

2 结果

2.1 PANs-BSA复合物粒径分析

将一定体积的PANs溶液（0.25 mg/ml）分别与质量浓度为0.1 mg/ml和0.025 mg/ml的BSA溶液混合后，动态光散射数据显示：平均粒径从192.2 nm分别增至195.4 nm和201.5 nm，虽然肉眼观察溶液状态无明显改变，但其粒径增加表明BSA吸附于纳米粒子表面并形成复合物。同时，高质量浓度的BSA没有低质量浓度组粒径变化明显，说明高质量浓度条件下BSA分子有部分穿插于普鲁兰纳米粒子中，形成紧密复合物状态，而低质量浓度条件下BSA吸附于纳米粒子表面形成疏松态[10]。

2.2 PANs-BSA复合物荧光强度及虚拟缔合常数的测定

BSA的等电点为4.7，分子质量为6.7×104u，是由585个氨基酸组成的单链传输蛋白。BSA具有17个二硫键和2个色氨酸残基（Trp135和Trp214），且半胱氨酸Cys34位含有1个自由巯基。BSA中的色氨酸残基在295 nm的激发波长下产生荧光，其最大发射波长为342 nm；而PANs在上述范围内不发射荧光，对BSA存在不同程度的荧光猝灭效应。因此，若加入PANs后，BSA的荧光强度减弱，说明PANs与BSA之间的缔合作用改变了两者结合位点附近BSA的三级结构。当BSA的质量浓度为0.25 mg/ml时，通过改变PANs的质量浓度（0～0.25 mg/ml），两者混合后的荧光强度如图1所示，在PANs-BSA复合物的形成过程中，随着PANs质量浓度的增加，BSA在342 nm处的荧光发射强度逐渐降低，2 h时和混合即刻（0 h）相比，荧光发射强度变化不显著，说明复合物形成速度较快。

图1 不同质量浓度的PANs与质量浓度为0.25 mg/ml的BSA混合后的荧光强度

当PANs在一定质量浓度范围内，可采用Stern-Volmer分析来估算PANs和BSA（0.25 mg/ml）之间的缔合常数（Kq），该常数反映了两种物质间的缔合情况。测定342 nm处的荧光强度，对PANs的质量浓度（0.015～0.25 mg/ml）作图（图2），然后按公式计算求得Kq，对应的Kq值分别为2.64×104、6.21×104、8.21×104、1.81×105和3.55×105，说明PANs和BSA之间存在着较强的相互作用，且随着PANs质量浓度的增加相互作用增强。

2.3 CD法检测PANs-BSA复合物的性质

由图3可知，加入PANs前后，BSA的CD光谱在221 nm和208 nm处均出现2个负峰，为α-螺旋的典型谱图，表明BSA以及PANs-BSA复合物中均存在α-螺旋结构。同时，加入PANs后，负峰位置上移，说明PANs与BSA之间发生了缔合，导致BSA的平均残基摩尔椭圆度绝对值减小，PANs与BSA的相互作用导致BSA分子的二级结构发生了变化。

在考察蛋白变性剂尿素对BSA和PANs-BSA蛋白稳定性的影响时发现，游离的BSA在加入尿素（2～10 mmol/ml）后，CD光谱在208与222 nm处的2个负峰随着尿素浓度的增加而向上迁移（图4A）；PANs-BSA复合物在加入尿素后，CD光谱的变化也很明显，且峰形几乎与游离BSA具有相同的特征（图4B）。尤其当尿素浓度增至6 mmol/ml时，CD光谱的峰形呈变性蛋白的无规卷曲构型的特征，说明BSA发生了变性，BSA分子中的α-螺旋结构遭到破坏。图5为变性剂尿素存在下，游离BSA和不同质量浓度的PANs与BSA混合后的复合物在222 nm处的平均椭圆度和尿素浓度的关系曲线。游离BSA在222 nm处的平均椭圆度随尿素浓度的增加变化较大；同时，随着复合物中PANs含量的增加，复合物在222 nm处的平均椭圆度的变化趋势与游离BSA一致，未见PANs的加入使复合物有显著对抗蛋白变性的能力。

进一步考察游离和复合的BSA水溶液的热变性趋势发现，以0.75℃/min升温模式从20℃加热至100℃时，当温度达到60℃时，游离BSA在222 nm处平均椭圆度迅速上升，证实该温度为BSA的变性温度。加热PANs-BSA复合物后BSA的CD光谱的形状改变与游离BSA也基本一致，说明PANs与BSA混合形成复合物后，加热仍对BSA的二级结构造成了破坏。（图6）

3 讨论

药物与白蛋白相互作用的研究主要包括蛋白-药物结合位点数与结合常数、结合位置、结合力类型和机理探讨等[5，11]。蛋白在溶液中存在多种二级结构，在加入纳米粒子后，由于蛋白与纳米粒子结合，或多或少会对蛋白构型产生影响，诱导蛋白结构发生一些变化，如折叠以及去折叠等。研究蛋白与药物相互作用的主要方法有荧光法、平衡透析法、CD法、紫外光谱法和红外光谱法等[9，12]，通常采用多种方法结合研究蛋白构型的变化。BSA是一种典型的球状蛋白，性质比较稳定，其分子中含有色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光的激发下，通过考察纳米粒子对蛋白的荧光碎灭，可获取许多纳米粒子进入体液中的可能特征。

图5 BSA和PANs-BSA复合物的平均椭圆度（222 nm）和尿素浓度的关系曲线

图6 温度对BSA和PANs-BSA圆二色光谱的影响

研究结果表明，BSA影响了纳米粒子的粒径，且随着PANs质量浓度的增加，BSA的荧光发射强度逐渐降低，这可能是由于PANs同BSA之间的缔合作用使BSA发生了荧光猝灭；混合后2 h时和混合即刻相比，荧光发射强度变化不显著，说明PANs与BSA混合后，迅速影响其荧光强度，具有浓度效应关系。虽然该法是目前检测两亲性表面活性剂和蛋白质之间相互作用的经典方法，但Kq值的大小仅仅反映BSA分子中的色氨酸残基和PANs分子中疏水结构域之间的相互作用，而实际上BSA与PANs之间不仅存在疏水相互作用，由于其分子中含有大量的极性基团（—COOH、—OH），两者间还可能存在氢键等弱相互作用。

CD光谱可提供蛋白和核酸的二级结构信息，也可检测配体与生物大分子的结合作用[2，11]。CD光谱分区如下：紫外区段（190～240 nm），主要生色团是肽链，这一波长范围的CD光谱包含着生物大分子主链构象的信息；近紫外区段（240～300 nm），占支配地位的生色团为芳香胺基侧链，这一区域可给出“局域”侧链间相互作用的信息；波长＞300 nm的区段（包括可见区段），对CD光谱的贡献主要来自含有金属离子的生色团，这一波段的CD光谱对金属离子的氧化态、配位态以及链－链间的相互作用较为敏感。本研究考查了BSA、PANs-BSA复合物以及对抗变性剂尿素和高温的椭圆度值变化趋势，结果表明PANs使BSA的二级结构发生了改变，α-螺旋数目随着变性程度增加而减少，说明PANs与BSA之间具有相互作用，这种相互作用可能是蛋白的吸附，也可能是因为纳米粒子周围蛋白“corona”的形成，但这种相互作用还不能使BSA免受变性剂尿素和高温的影响。

4 结论

PANs和BSA充分混合后能形成复合物，其缔合常数高达3.55×105；但PANs-BSA复合物与游离BSA相比，其对抗变性剂和高温的能力未见显著增强。本研究为普鲁兰基纳米粒子与蛋白间相互作用的研究提供了科学依据，而蛋白对普鲁兰载药纳米粒子稳定性和药物释放行为等影响尚待进一步考察。

利益冲突 无

（图2～4见封三）

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Interaction between bovine serum albumin and pullulan acetate nanoparticles

Tang Hongbo,Zhang Tong,Tao Xiaojun,Du Bo,Feng Xin,Zhang Qiqing
Department of Pharmacy,Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University,Beijing 100006, China(Tang HB,Feng X);Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China(Tang HB,Zhang T, Tao XJ,Du B,Zhang QQ) Corresponding author:Zhang Qiqing,Email:zhangqiq@126.com;Feng Xin,Email:fengxin1115@126.com

Objective To investigate the interaction of pullulan acetate nanoparticles(PANs)and bovine serum albumin(BSA),and to provide the basis for in vivo pharmacokinetic study of PANs.Methods Mixed solutions of different concentration of PANs and BSA solution was prepared,the interaction was studied by fluorescence quenching method and circular dichroism(CD)measurement.Apparent quenching constant(Kq)between the PANs and BSA was calculated,and the anti-stress effect induced by urea and heating of PANs-BSA solution was observed. Results The fluorescence spectrum of BSA was affected by PANs on density-related manner,and Kqcalculated by the modified Stern-Volmer plot increased from 2.64×104to 3.55×105with the concentration of PANs increased from 0.015 mg/ml to 0.25 mg/ml.With the denaturation of urea or heating,the CD spectrum of PANs-BSA and free BSA had the similar variation tendency.Conclusions The fluorescence spectrum display results show that interaction between PANs and BSA exists,but the interaction does not protect the BSA from degeneration by urea and heating.

Pullulan acetate; Bovine serum albumin; Nanoparticles; Fluorescence spectrum; Circular dichroism

National Natural Science Foundation of China(81301322)

张其清，Email：zhangqiq@126.com；冯欣，Email：fengxin1115@126.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．02．004

国家自然科学基金（81301322）

2015-12-22）