马景景 刘晓璇 孙志婷 刘兰霞 冷希岗

300192天津，中国医学科学院 北京协和医学院生物医学工程研究所

·论著·

功能化修饰多壁碳纳米管对人外周血单个核细胞的毒性研究

马景景 刘晓璇 孙志婷 刘兰霞 冷希岗

300192天津，中国医学科学院 北京协和医学院生物医学工程研究所

目的 探讨不同功能化修饰的多壁碳纳米管（F-MWCNTs）对人外周血单个核细胞（PBMC）的细胞毒性的影响。 方法 利用透射电镜表征5种直径和长度均相同的MWCNTs（羟基、羧基、氨基、镀镍修饰和未修饰的MWCNTs（P-MWCNTs））在生理盐水溶液中的分散性。体外实验中先通过Ficoll密度梯度离心从人外周血中分离出PBMC，再将5种MWCNTs分别超声分散于含血清的培养基中，与PBMC共培养12、24、48、72 h，通过CCK-8试剂盒检测5种MWCNTs对PBMC的细胞毒性。结果 5种MWCNTs的分散性相对良好，尤其是各F-MWCNTs。细胞毒性实验结果表明，MWCNTs的细胞毒性呈剂量-效应关系和一定的时间-效应关系。F-MWCNTs与P-MWCNTs相比，细胞毒性发生显著变化，其中羟基、羧基和氨基修饰的MWCNTs的细胞毒性减小，尤以氨基修饰的细胞毒性减小最为显著（P＜0.05）；而镀镍修饰的MWCNTs的细胞毒性反而明显增大，其处理细胞24 h和48 h时的细胞存活率较同剂量（25 μg/ml）的P-MWCNTs均有所降低，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。 结论 功能化修饰不仅影响MWCNTs在水溶液中的分散性，还影响MWCNTs对人外周血淋巴细胞的细胞毒性。

多壁碳纳米管； 人外周血单个核细胞； 细胞毒性； 功能化修饰

0 引言

碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）因其独特的空间结构和优良的电热理化性能，广泛应用于电子器件、复合材料及生物医药等众多领域[1-2]。CNTs根据其管壁层数，分为单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes,SWCNTs）和多壁碳纳米管（multiwalled carbon nanotubes,MWCNTs）；根据其表面是否被修饰，分为未修饰的碳纳米管（pristine CNTs，P-CNTs）和功能化修饰的碳纳米管（functionalized CNTs，F-CNTs）。P-CNTs呈疏水性，在生理溶液下容易聚集成束，进入机体后易被吞噬细胞吞噬导致细胞坏死或凋亡，从而限制了其在生物医学方面的应用。通过对CNTs表面进行功能化修饰，不仅可改善其表面特性，提高其生物相容性，还可作为药物递送载体靶向输运药物[3]。对CNTs的功能化修饰通常有以下几种方式：通过侧壁吸附生物活性分子；将生物分子共价连接于CNTs表面；将分子包裹于CNTs腔内[4]。近年来，研究人员对纳米材料作为药物载体产生了浓厚兴趣[5]。其中CNTs作为药物载体用于各种癌症的治疗受到诸多学者的青睐，通过将紫杉醇、阿霉素等治疗药物结合于CNTs表面，凭借CNTs高负载率、靶向性和控制释放的优势从而达到良好的抗癌效果[6-7]。

鉴于CNTs的广泛应用，关于其生物安全方面的研究显得极其重要。近年来，关于CNTs的生物毒性评价的研究逐渐增多，如对血液循环、淋巴回流、肺部及心脏等的影响[8-9]。由于CNTs很轻，易分散于空气中被人吸入，因此关于CNTs对人肺部毒性的研究是最早被关注的。大量实验证实：将一定量的CNTs灌注入小鼠体内，会引起肺部炎症、氧化损伤和纤维化[10]。近几年关于CNTs的免疫毒性研究也逐渐增多，大多是研究CNTs对单个免疫细胞的影响，包括巨噬细胞、T淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞等[11]。由于免疫细胞之间是通过相互作用来发挥作用的，本研究以人外周血单个核细胞（human peripheral blood mononuclear cell,PBMC）为研究对象，研究了未修饰的MWCNTs（P-MWCNTs）和4种不同功能化修饰的MWCNTs（F-MWCNTs）对PBMC的毒性影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

5种MWCNTs（羟基、羧基、氨基、镀镍修饰的MWCNTs及P-MWCNTs）（北京德科岛金科技有限公司），淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），RPMI 1640培养基（美国HyClone公司），胎牛血清（美国Gibco公司），微栅（北京新兴百瑞技术有限公司），细胞增殖-毒性试剂盒（CCK-8 kit）（日本同仁化学研究所）。SpectraMaxPlus384酶标仪（美国Molecular Devices公司），Tecnai GZ F20透射电镜（荷兰FEI公司），Sigma 2-16K离心机（德国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 MWCNTs悬液的制备

分别称取5种MWCNTs各10 mg，置于20 ml的玻璃瓶中，加入10 ml含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，使MWCNTs的最终质量浓度为1 mg/ml，室温下以70%功率超声30 min，然后12 000×g离心5 min，收集悬液备用。

1.2.2 透射电镜观察

将MWCNTs悬液稀释至肉眼可见黑色，用移液枪吸取10 μl稀释后的悬液，滴于微栅的支持膜面，再将微栅置于干净滤纸上晾干，即可用透射电镜观察并测量MWCNTs的直径。

1.2.3 PBMC的分离

在10 ml离心管中加入4 ml Ficoll淋巴细胞分离液，取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液充分混匀，用吸管沿管壁将其缓慢叠加于分层液面上，注意保持界面清晰；然后于室温下450×g离心20 min，离心后管内细胞分为3层，上层为血浆和Hank's液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一以PBMC为主的白色云雾层狭窄带（图1）。将移液器小心插入云雾层，吸取PBMC。置入10 ml玻璃离心管中，加入5倍体积的Hank's液，300×g离心10 min，按该法洗涤细胞两次；末次离心后，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，重悬细胞；取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数4个大方格内的细胞总数，再按以下公式计算PBMC的浓度

PBMC浓度（细胞数/1 ml细胞悬液）＝4个大方格内细胞总数/4×104×稀释倍数

1.2.4 细胞毒性实验

细胞计数后向PBMC中加入含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基；然后以2×106个细胞/孔铺板，每孔200μl；随后向实验组中分别加入MWCNTs悬液，使得MWCNTs的最终质量浓度分别为25或50 μg/ml，阳性对照组中加入终质量浓度为50 μg/ml的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），阴性对照组则只有含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培

图1 密度梯度离心分离PBMC

养基，置于5%CO2的37℃培养箱中分别培养12、24、48、72 h；再向每孔中加入20 μl CCK-8溶液，于37℃培养箱中避光孵育2 h；分别取各孔上清液100 μl，加至一新96孔板的相应孔中，用酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD）值，再以≥600 nm的任一波长为参考波长进行双波长测定，计算细胞存活率

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析法进行统计学处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MWCNTs的表征

MWCNTs在水中的分散性可能会影响其毒性及免疫安全性评价结果。本研究采用透射电镜对5种MWCNTs的形态及分散性进行了表征，结果如图2所示，5种MWCNTs的分散性良好，其中F-MWCNTs的分散性优于P-MWCNTs。材料购买时提供的和通过透射电镜表征得到的部分参数见表1，其中直径1和长度是样品说明书标注的，直径2是将MWCNTs分散于水溶液中，经透射电镜测得。

2.2 不同表面修饰的MWCNTs对PBMC细胞存活率的影响

细胞毒结果如图3显示，在12、24、48和72 h的各时间点，5种MWCNTs处理PBMC的存活率均随浓度升高而下降，其中50μg/ml氨基修饰的MWCNTs处理PBMC 12 h时的细胞存活率较25 μg/ml处理下的存活率低（P＜0.05）；类似的，50 μg/ml羧基、氨基及镀镍修饰的MWCNTs处理PBMC 72 h时的细胞存活率也分别较25 μg/ml处理下的存活率低，差异均具有统计学意义（P＜0.05），表现出一定的剂量-效应关系。在48 h内MWCNTs处理PBMC的存活率随处理时间的延长而逐渐降低，其中与12 h时相比，25 μg/ml的羧基修饰的MWCNTs（P＜0.01）、镀镍修饰的MWCNTs（P＜0.05）和50 μg/ml的羟基修饰的MWCNTs（P＜0.05）处理PBMC 24 h时的细胞存活率均有所降低；与24 h时相比，除镀镍修饰外的其他4种MWCNTs分别以2种质量浓度处理PBMC 48 h时的细胞存活率均降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05），表现出一定的时间-效应关系。然而，低质量浓度25 μg/ml的4种F-MWCNTs处理PBMC 72 h时的细胞存活率反而较48 h时增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明PBMC对MWCNTs有一定的应激反应。

表1 5种多壁碳纳米管的类型及参数

与P-MWCNTs相比，F-MWCNTs的细胞毒性发生了变化，其中羟基、羧基和氨基修饰的MWCNTs的细胞毒性减小，尤以氨基修饰的细胞毒性减小最为显著（P＜0.05）；而镀镍修饰的MWCNTs的细胞毒性则明显增大，其处理PBMC 24 h和48 h的细胞存活率较同剂量（25μg/ml）的P-MWCNTs均有所降低，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。各时间点相同质量浓度的羟基、羧基和氨基修饰的MWCNTs细胞毒性间差异并无统计学意义（P＞0.05）。

图2 5种MWCNTs的透射电镜图

图3 与MWCNTs共孵育不同时间后PBMC的细胞存活率

3 讨论与结论

PBMC包括多种免疫细胞类型，CNTs作为药物载体常以静脉注射的方式给药[12]，因此，研究CNTs对PBMC的细胞毒性对评价其毒性具有重要意义。本研究结果显示，与P-MWCNTs相比，羟基、羧基和氨基化修饰不仅改善了MWCNTs在水溶液中的分散性，而且减弱了其对PBMC的细胞毒性，尤以氨基修饰的细胞毒性减弱最为显著（P＜0.05）；而羟基、羧基和氨基修饰的MWCNTs之间的细胞毒性比较，差异则无统计学意义（P＞0.05）。由此推断P-MWCNTs的细胞毒性较大，可能主要是由于其在水溶液中易于聚集所致。有研究表明修饰可降低CNTs引起的细胞线粒体凋亡，也有研究表明功能化修饰可降低CNTs对DNA的损伤、减少NLRP3炎性体的活性，从而提高其生物相容性[13-14]。

镀镍修饰的MWCNTs广泛应用于葡萄糖传感器的电极，因其具有稳定性好、可重复性强和快速准确等优点，已成为此专业的研究焦点[15]。细胞毒性研究结果表明，镀镍修饰的MWCNTs显著增强了对PBMC的细胞毒性。已有研究表明，金属镍可通过引

起损伤DNA、抑制DNA损伤修复酶的活性、产生活性氧导致氧化损伤或阻断细胞周期于G2/M期等引起细胞凋亡或坏死[16]。

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Effects of functionalization of multi-walled carbon nanotubes on human peripheral blood mononuclear cell

Ma Jingjing,Liu Xiaoxuan,Sun Zhiting,Liu Lanxia,Leng Xigang
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China Corresponding author:Liu Lanxia,Email:liulanxiabme@163.com

Objective To explore the effects of surface functionalized multi-walled carbon nanotubes(FMWCNTs)on the cytotoxicity of human peripheral blood mononuclear cell(PBMC).Methods Five different types of MWCNTs(hydroxylated,carboxylated,aminated,nickel-plated and pristine MWCNTs(P-MWCNTs))with the same diameter and length were evaluated the dispersion and characterizations in physiological salt solution by transmission electron microscopy.PBMC were isolated by density gradient centrifugation from human peripheral blood,and 5 types of MWCNTs were ultrasonically dispersed in serum-containing medium respectively.After incubation with PBMC for 12,24,48 or 72 h,cytotoxicity was detected by CCK-8 kits.Results All the MWCNTs had well dispersion, especially the F-MWCNTs.Cytotoxicity results showed that all types of MWCNTs could induced PBMC death,and presented dose-dependence manner and a certain degree of time-dependence manner.Compared with the PMWCNTs,F-MWCNTs changed cytotoxicity statistically,with the hydroxylated,carboxylated,aminated MWCNTs weakened,aminated MWCNTs significant(P＜0.05),nevertheless the nickel-plated MWCNTs increased.Compared with the P-MWCNTs(25 μg/ml),cell viability of PBMC after 24 and 48 h incubation with the same dose of nickelplated MWCNTs both decreased,and the differences was statistically significant(P＜0.01,P＜0.05).Conclusions The functional group modification affects not only the MWCNTs dispersion in medium,but also the cytotoxicity of the MWCNTs on PBMC.

Multi-walled carbon nanotubes; Human peripheral blood mononuclear cell; Cytotoxicity; Functionalization

National Natural Science Foundation of Youth Foundation of China(31200674);Tianjin Science and Technology Program Jointly Funded Project Surface(15JCYBJC47600)

刘兰霞，liulanxiabme@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．02．003

国家自然科学基金青年基金（31200674）；天津市科技计划联合资助面上项目（15JCYBJC47600）

2015-12-20）

综上所述，功能化修饰MWCNTs不仅影响其表面特性，也影响其对PBMC的细胞毒性。因此在对CNTs进行功能化修饰时，除了注重其应用方面的研究，还要考察其相关的毒性问题。

利益冲突 无