范 霞，孙钰椋，朱 川，周防震

（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000）

二氧化碳厌氧处理对藤茶GABA含量的影响

范 霞，孙钰椋，朱 川，周防震＊

（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000）

为制备富含γ－氨基丁酸（GABA）藤茶（Ampelopsis grossedentata），采用二氧化碳（CO2）厌氧处理野生藤茶和人工栽培藤茶鲜叶，经杀青、烘干和粉碎后，利用丙酮和AlCl3去除色素，分光光度法测定藤茶中GABA的含量。结果表明：未厌氧处理时，藤茶中GABA含量为0.874 9～1.270 7mg／g；而CO2厌氧处理4h，野生藤茶和人工藤茶中GABA含量均达最高值，分别为1.751 8mg／g和2.509 3mg／g；CO2厌氧处理4h能显著提高野生藤茶和人工藤茶GABA的含量。

藤茶；γ－氨基丁酸；厌氧处理

γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）是哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质［1］，广泛存在于动植物体内，具有降血压、保持神经安定，改善大脑机能和增强记忆等多种药理作用［2］，具有较大的开发和利用价值。高等植物中GABA的合成主要由L－谷氨酸脱羧而来，这一反应由L－谷氨酸脱羧酶催化。研究表明，厌氧处理可激活L－谷氨酸脱羧酶的活性［3］，进而可间接增加植物中GABA的含量。将普通的鲜茶叶经过一定时间的厌氧处理使谷氨酸在谷氨酸脱羧酶作用下脱去羧基，生成GABA，国内外已有报道，并已有产品销售。如日本学者通过厌氧和应激处理，使普通春茶GABA的含量达2.02mg／g（干重），夏茶GABA的含量达0.86～1.14mg／g［4］，而普通加工茶叶虽然谷氨酸的含量丰富，达1.78～4.95mg／g，但GABA仅有0.02～0.22mg／g［5］。

藤茶（Ampelopsis grossedentata）是一种古老的药食两用植物，长期作为类茶植物和中草药在民间广泛使用，近年来逐渐成为研究热点［6－7］。有研究表明，藤茶主要活性成分为二氢杨梅素，具有抗氧化、保肝护肝和抗肿瘤等多种药理活性［8］，其鲜叶中谷氨酸含量达3.25mg／g［8］，远高于普通茶叶中谷氨酸含量，具有制备富含GABA功能藤茶的巨大潜力。但迄今为止，国内外尚无利用富含谷氨酸藤茶为材料生产富含GABA藤茶的报道。为制备富含GABA的藤茶，试验以藤茶鲜叶为材料，探讨CO2厌氧处理对藤茶中GABA含量的影响，以期为制备GABA功能藤茶奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

野生藤茶和人工栽培藤茶鲜叶：于2015年5月1日采自湖北省恩施土家族苗族自治州来凤县大河镇两河口集镇。

试剂：丙酮、无水三氯化铝和氢氧化钾（天津市福晨化学试剂厂），无水乙醇、次氯酸钠和γ－氨基丁酸标准品（国药集团化学试剂有限公司），重蒸酚（北京索莱宝科技有限公司），四硼酸钠（天津市天达净化材料精细化工厂），以上试剂均为分析纯。

仪器设备：小型高速冷冻离心机（Eppendorf公司），精密pH计（PHS－4C型，成都方舟科技开发公司），恒温水浴锅（HH－4，金坛市科兴仪器厂），粉碎机（广东天际电器有限公司），电子天平（上海精天电子仪器有限公司），Infinite M200PRO全波段多功能酶标仪（TECAN公司），电热恒温干燥箱（上海一恒科技有限公司），移液枪（Eppendorf公司），PET／PE透明真空包装袋（河北东光县立新塑料包装有限公司），DZ－280／DZ－300A小型真空包装机（温州卓越机电有限公司），CO2厌氧产气袋及2.5L密封罐（日本三菱瓦斯化学株式会社）。

1.2 藤茶鲜叶的处理

取藤茶鲜叶100g多份，分别置于密封罐室温、CO2厌氧条件下（密封罐内放置CO2厌氧产气袋）处理0h、4h、8h和12h。然后微波（110～115oC）杀青1～2min，每30s拌匀1次。然后80℃干燥至恒重，粉碎后过40目筛，置干燥器备用。各处理4次重复。

1.3 藤茶中GABA的提取

称取0.4g藤茶叶干样，加入装有7mL丙酮的离心管中，室温振荡15min，8 000r／min离心15min，弃上清。分别再加7mL和5mL丙酮，重复上述过程，沉淀静置干燥。待完全干燥后，加水4mL，50℃水浴中振荡提取2h，8 000r／min离心15min，取上清液，低温保存备用。

1.4 藤茶中GABA的含量测定

分别取1mL样品提取液，加入2mol／L的AlCl3溶液50μL，混匀后室温振荡15min，12 000r／min离心5min，取上清液0.5mL加入1mol／L的KOH溶液300μL，室温振荡5min，12 000r／min离心5min。分别取上清液300μL，加0.1mol／L的四硼酸钠缓冲溶液500μL（pH 10.0），6%的重蒸酚400μL，混匀后再加入5%的NaClO溶液600μL，充分混匀。于沸水浴中加热10min，立即置于冰浴中5min，待溶液出现蓝绿色后，加入60%乙醇2.0mL，取200μL于96孔板中，于645nm波长处用酶标仪测定吸光值。藤茶GABA的含量按下式计算

GABA质量比（mg／g）＝C×V／m

式中，C为直线方程计算的值（mg／mL），V为样品提取液的总体积（mL），m为样品质量（g）。

1.5 绘制标准曲线

准确称取GABA标准品0.010g，用蒸馏水溶解并定容至10mL，等量稀释，依次配成浓度为1mg／mL、0.5mg／mL、0.25mg／mL、0.125mg／mL和0.062 5mg／mL的标准溶液。分别取1mL不同浓度的标准液，同1.4处理。以吸光值为纵坐标，GABA的浓度（mg／mL）为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

由图1可见，在0.062 5～1.0mg／mL，GABA浓度与645nm波长吸光值之间具有良好的线性关系，其线性方程为y＝0.343 54x＋0.102 59，决定系数R2＝0.991 07。

2.2 CO2厌氧处理对藤茶GABA含量的影响

由图2可知，CO2厌氧处理0～12h，人工藤茶和野生藤茶GABA含量均显著增加，且呈先增加后减少趋势，其中处理4h的GABA含量最高，分别为2.509 3mg／g和1.751 8mg／g，人工藤茶中的GABA含量显著高于野生藤茶。CO2厌氧处理8h和12h人工藤茶GABA含量均显著低于厌氧处理4h组（P＜0.05）；CO2厌氧处理8h和12h，野生藤茶的GABA含量与厌氧处理4h无显著差异。未厌氧处理时，野生藤茶中GABA的含量为1.2707mg／g，显著高于人工栽培藤茶（0.874 9mg／g）。

图1 GABA标准曲线Fig.1 The standard curve of GABA

图2 CO2厌氧处理人工和野生藤茶的GABA含量Fig.2 Effect of CO2anaerobic treatment on GABA content in wild and home planted Ampelosis grossedentata leaves

3 结论与讨论

试验结果显示，藤茶中GABA的含量为0.874 9～1.270 7mg／g；CO2厌氧处理4h，藤茶GABA的含量达1.751 8～2.509 3mg／g，即厌氧处理可以显著增加藤茶中的GABA含量。普通茶中GAGA的含量为0.02～0.22mg／g，厌氧处理条件下，其GABA的含量为0.86～2.02mg／g［45］。可见，藤茶中GABA的含量明显高于普通茶（山茶科）。

有研究指出，当植物受到厌氧、冷激和机械伤害等逆境条件时，体内GABA含量将显著增加，其中以低氧厌氧逆境效果最佳［9］。试验中，CO2厌氧条件下，藤茶中GABA含量先增加后减小，可能与在CO2厌氧产气袋吸收密封罐中O2，释放CO2过程中，早期尚有低浓度O2有关。低氧胁迫条件下，植物通过磷酸戊糖途经减少有毒物质的积累，生成谷氨酸和GABA以抵御逆境胁迫，调节细胞酸度，在此条件下，谷氨酸脱羧酶活性得到激活，促使谷氨酸向GABA的转化［10］。而长时间的处理（8h和12h），导致GABA的含量出现下降，与林智等［11］的研究结果一致，可能与GABA的稳定性有关。

藤茶中GABA的含量明显高于普通茶，与藤茶中谷氨酸的含量明显高于普通茶中的谷氨酸含量趋势一致；暗示较高的谷氨酸含量可能有利于谷氨酸脱羧酶活性的提高，进而促进GABA的积累。试验野生藤茶中GABA含量高于人工藤茶，但厌氧处理4h条件下，人工藤茶的GABA含量显著高于野生藤茶，是否意味着野生藤茶的谷氨酸含量更低，还是存在其他机制，有待进一步研究。

［1］夏玉玲，徐立，杨翠凤.桑叶中γ－氨基丁酸含量的测定［J］.中国农学通讯，2009，25（20）：209－212.

［2］张辉，徐满英.γ－氨基丁酸作用的研究进展［J］.哈尔滨医科大学学报，2006，6（3）：267－269.

［3］DENNISON K L，SPALDING E P.Glutamate－gated calcium fluxes in Arabidopsis［J］.Plant Physiology， 2000，124（4）：1511－1514.

［4］SAWAI Y，YAMAGUCHI Y，MIYAMA D，et al.Cycling treatment of anaerobic and aerobic incubation increase the content ofγ－aminobutyric acid in tea shoots［J］.Amino acids，2001，20：331－334.

［5］廖明星.茶叶中γ－氨基丁酸（GABA）富集技术研究［D］.南京：南京农业大学，2004.

［6］晏和娟，伍莉娟，郑小江，等.藤茶活性成分二氢杨梅素对明胶酶的影响［J］.中国酿造，2014，33（10）：81－83.

［7］赛娜，周防震.二氢杨梅素对MDA－MB－231人乳腺癌细胞端粒酶活性的影响［J］.湖北民族学院学报（医学版），2013，30（4）：19－21，25.

［8］周防震，郑小江.中国良种－藤茶［M］.湖北科学技术出版社，2016.

［9］REGGIANI R，CABTU C A，BRAMBILLA I，et al.Accumulation and interconversion of amino acids in rice roots under anoxia［J］.Plant cell physiol，1988，29（6）：981－987.

［10］CRAWFORD L A，BOWN A W，BREITKREUZ K E，et al.The synthesis ofγ–aminobutryric acid in response to treatments reducing cytosolic pH［J］.Plant physiology，1994，104（3）：865－871.

［11］林智，林钟鸣，尹军峰，等.厌氧处理对茶叶中γ－氨基丁酸含量及其品质的影响［J］.食品科学，2004，25（2）：35－39.

（责任编辑：孙小岚）

Effect of CO2Anaerobic Treatment onγ－aminobutyric acid（GABA）Content in Ampelosis grossedentata

FAN Xia，SUN Yuliang，ZHU Chuan，ZHOU Fangzhen＊
（School of biological science anDTechnology，Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000，China）

The GABA content in wild and home planted A.grossedentata flesh leaves treated with CO2，was determined by spectrophotometry after fixation，drying，smash and pigment removal processing technology to produce A.grossedentata with high GABA content.Results：The GABA content in untreated wild and home planted A.grossedentataflesh leaves is 0.874 9～1.270 7mg／g but the GABA content in wild and home planted A.grossedentataflesh leaves treated with CO2for 4hreaches 1.751 8mg／g and 2.509 3mg／g respectively，which indicates CO2treatment for 4hcan improve GABA content in wild and home planted Ampelosis grossedentata significantly.

Ampelosis grossedentata；γ－aminobutyric acid（GABA）；anaerobic treatment

S888.2

A

1001－3601（2016）10－0442－0132－03

2016－06－04；2016－09－28修回

高校青年教师服务企业行动项目“来凤县向班贵藤茶有限公司”（XD2014209）；大学生创新训练计划项目“厌氧处理对藤茶中GABA含量的影响”（201310517007）

范 霞（1992－），女，在读硕士，研究方向：生物工程。E－mail：1299841016＠qq.com

＊通讯作者：周防震（1976－），男，副教授，博士，从事天然产物开发研究。E－mail：tentzf.student＠sina.com