陈红军（河南省濮阳市油田总医院药剂科，河南 濮阳 457000）

神州药房

野生刺五加内生真菌分离与鉴定

陈红军
（河南省濮阳市油田总医院药剂科，河南 濮阳 457000）

刺五加为中医临床常用中药，含有多种有效成分，药用价值极高。现阶段，国内外对刺五加的研究不断深入，但是多以外在环境对植物体药用成分的影响为主，忽略了内环境的影响。研究与实践证实［1］，体外培养刺五加的药用成分与效果远低于野生刺五加，并且成分相对不稳定。内生真菌会利用自身活动、代谢产物，对宿

主次级代谢产生一定程度的影响［2］。我们对野生刺五加内生真菌分离与鉴定进行分析探讨，报道如下。

1 研究材料

刺五加样品来源于2014年6月至12月吉林省梅河口市、辽宁省本溪市、吉林省柳河县、黑龙江省穆棱市、河北省兴隆县等几个地区的野生刺五加药材。培养基选择PDA培养基、马丁氏培养基、LCA培养基等。

2 研究方法

采取刺五加茎组织分离方法，对内生真菌进行分离、鉴定。

内生真菌分离。采取流水冲洗刺五加，将植株上的土去掉，按照根、茎、根茎等次序进行分割，并进行表面的彻底消毒，消毒顺序为首先经无菌水冲洗，而后采用95%乙醇漂洗1min，经6%NaClO浸洗3min，经75%的乙醇漂洗半分钟，再次用无菌水漂洗3次，最后经无菌滤纸吸干。一系列处理后，将韧皮部、木质部进行无菌分离，将韧皮部切成0.5cm×0.5cm的薄片，而后将薄片经直插、水平贴附方式放置在分离平板上，25℃～28℃条件下进行暗培养，材料边缘长出菌丝后挑取菌丝尖端转入平板，展开分离，顶端法纯化后转接至斜面。同时设置对照试验，对植株表面是否彻底消毒进行检查，经上述条件处理过的材料，不进行切割，直接滚印在对照平板上，最后一次漂洗过的无菌水涂布在对照平板上，同样的条件下进行培养。

菌株形态学鉴定。对菌落表面形态、颜色、大小、质地、生长速度、边缘形态等进行仔细观察，经插片法在显微镜下对产孢结构、孢子形态、菌丝颜色、是否存在横隔等特征进行观察。

内生真菌鉴定。挑取纯化菌株尖端菌丝，将其接种在PDA培养基上，倒置于恒温培养箱中，25℃条件下培养，对菌落形态特征、生长情况进行观察，而后进行内生真菌的鉴定、分类。

3 结 果

3.1 内生真菌培养分离结果

统计发现，自野生刺五加茎中共计分离内生真菌25株，共4目、7科、9属。丛梗孢目中包括丛梗孢科、暗色孢科、瘤座孢科、肉座菌科，丛梗孢科包括曲霉属1株，暗色孢科包括有长蠕孢属1株、枝顶孢酶属1株，链格孢属3株，瘤座孢科中包括镰孢属2株，肉座菌科包括赤霉素属1株；散子囊菌目包括红曲霉科红曲霉属2株；毛霉目包括毛霉科根霉属1株，黑盘孢目包括黑盘孢科炭疽菌属1株；不产孢真菌共计12株。

3.2 菌株形态学鉴定

链格孢属：菌株在PDA培养基上，25℃条件下暗培养完成后，菌落形态较厚，菌丝体开始时呈现白色，而后逐渐变成褐色至暗褐色，存在明显的绒边，边缘相对整齐，存在裂片状或者波状。菌丝体细长、发达，有明显的隔，开始时没有颜色或者是淡淡的颜色，而后逐渐变成褐色至暗褐色。分生孢子梗单生或簇生，呈现出直或者是屈膝状弯曲，有隔，颜色褐色。分生孢子具有明显的分支状长链，颜色暗褐色。

镰孢属：菌落形态、显微结构鉴别发现，初期菌丝呈现为白色，随着菌落的不断扩大，颜色逐渐变为粉色，中间相对较深，边缘颜色较浅，培养基背面中间呈现粉红色；菌落分散呈现片状，表面粉状，不平整，边缘整齐。菌丝存在明显的分枝，有隔，分生孢子着生在菌丝之上。

长蠕孢属：菌落形状为圆形，表面开始呈现为灰色，生长一段时间后，中间颜色呈现为墨绿色，底部中间同样呈现为墨绿色，两边颜色相对较浅。显微镜观察菌丝较粗壮，颜色为绿色，有隔，直立或者是弯曲，存在明显分枝，孢子卵圆形或者是椭圆形。

赤霉属：菌落生长状态良好，平板培养完成后，菌落中央菌丝体的顶部长出了少量的，颜色为浅黄色的突起，后期菌落中央的颜色会逐渐变深。菌落背面呈现为深紫红色，菌落密集，呈现为棉絮状平展状态。显微镜观察基内菌丝存在密集交织，有分支，存在隔。

红曲霉属：菌落正面呈现出白色绒毛状，背面呈现为粉红色，边缘相对整齐。显微镜观察菌丝存在明显分枝，有隔，呈无色透明状，分生孢子呈现为卵圆形或者是球形，散在生存。

枝顶孢酶属：菌株生长正常，菌落呈现为明显的圆形，正面呈现为灰白色绒毛，显微镜观察分生孢子梗单生，1次分枝，梗呈现为柱状，分生孢子椭圆形或者是球形。

根霉属：生长状况良好，表面存在大量的黄色孢子，气生菌丝呈现为白色，稀疏，菌落的底面呈现为橙黄色，显微镜观察孢子囊存在明显的囊轴，壁薄，孢子囊破裂后释放，数量较多。

4 讨 论

目前，国内外对内生真菌的研究较多，多以内生真菌多样性、抗肿瘤、产抗菌等活性物质筛查为主，筛选的模型相对比较单一，使得有效物质的开发利用受到一定程度的限制［3］。关于内生真菌与宿主之间相互作用、作用机制等方面的研究，多以内生真菌对宿主直接或者是间接的促生作用为主［4-5］。研究结果发现，共计从野生刺五加植物中分离25株内生真菌，通过形态学鉴定，有13株确定菌株种属，另外的12株不产孢菌株被定义为不产孢真菌，分离结果证实，刺五加内生真菌种类繁多，数量较大。

综上所述，刺五加内生真菌具有生物多样性，其中链格孢属、镰孢属、红曲霉属等均有较高的分离度，属于稳定的优势菌属［6］。在其他木本植物中，上述菌属也为优势菌种，其能够适应植物生长环境，微生物营养要求、生理代谢等均与植物体内微环境、遗传、生理、代谢相互适应，在今后的研究中，应对其给予足够的重视［7］。

［1］ 陆晓东，王琦.骆驼蓬内生真菌抑菌活性的研究［J］.菌物研究，2010，12（2）：211-214.

［2］ 于湘莉，赵静雅，张利达，等.楸树内生真菌抗癌性能研究［J］.上海医药，2012，23（13）：784-785.

［3］ 解斐，娄红祥.地衣内生真菌及其活性次生代谢产物研究进展［J］.中药材，2013，11（4）：109-112.

［4］ 刘兆迪，解修超，陈文强，等.药用植物三尖杉内生真菌的分离鉴定及抗菌活性［J］.中国实验方剂学杂志，2014，25（9）：902-905.

［5］ 周凤，刘瑞，张弘弛，等.一株具抗菌活性的恒山黄芪内生真菌的分离与鉴定［J］.陕西科技大学学报（自然科学版），2012，15（3）：90-93.

［6］ 段海婧，韩婷，吴秀丽，等.荒漠植物牛心朴子内生真菌的分离与鉴定［J］.中国中药杂志，2013，17（3）：892-895.

［7］ 严寒静，高晓霞，何梦玲，等.鹰爪花茎和叶中内生真菌的组织化学定位与分子鉴定［J］.中国实验方剂学杂志，2013，11（13）：572-575.

R282.5 ［文献标识码］B

1004-2814（2016）07-0740-02

2016-02-29