段明, 王兴春,元旭朝

(1.山西农业大学 实验教学中心，山西 太谷 030801; 2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801;3.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)



番茄APX蛋白的表达分析

段明1, 王兴春2,元旭朝3

(1.山西农业大学 实验教学中心，山西 太谷 030801; 2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801;3.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

摘要：抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物体内重要的的抗氧化酶之一，在植物抵御外界的氧化胁迫中发挥着重要的作用。为了研究其功能特性，本研究以番茄为试材，将前期分离得到的APX基因编码区克隆至原核表达载体pET-30a中，经诱导表达纯化后，用该重组蛋白免疫小鼠制备抗体，用于Western蛋白表达分析。杂交结果表明，APX蛋白受低温、干旱的诱导，与基因在RNA水平上的表达模式一致，但APX蛋白对盐处理反应不敏感；H2O2处理后蛋白水平呈现出下降趋势，与基因表达变化趋势不一致，这或许是APX存在一种转录后调控的机制，有待进一步探讨。

关键词：番茄； 表达分析；APX基因

低温、干旱、盐渍等逆境是限制作物产量的主要因素，轻微时影响植株的生长，严重时可导致其死亡[1]。叶绿体是植物光合作用的重要场所，也是活性氧产生的主要部位。在叶绿体中，水首先发生光解生成氧气，电子通过光系统Ⅱ、中间传递体以及光系统Ⅰ传给氧分子，将其还原，产生超氧阴离子自由基。超氧阴离子在超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶的催化下生成水，整个过程就是著名的水-水循环-Mehler反应[2]。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)在植物的生长发育、代谢调控以及逆境中信号的传递和防御等方面都发挥了重要作用。浓度较低时对植物本身没有伤害，相反能够诱导体内某些抗氧化酶基因的表达[3,4]，但是，浓度较高时则会对植株产生负面效应，导致体内活性大分子降解，引起植物凋亡[5,6]。

ROS的清除和降解主要通过植物体内的抗氧化系统协同完成。主要包括抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidose, APX)在内的抗氧化酶等, 以及小分子的抗氧化剂如谷胱甘肽和抗坏血酸等。

APX是植物体内参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环的关键酶之一，特别是叶绿体中清除H2O2的重要酶。它的催化属于过氧化物酶的乒乓机制[7]。它以抗坏血酸(AsA)为电子供体，催化AsA与H2O2生成单脱氢抗坏血酸和H2O。

正因为APX在抗氧化方面的重要性，近年来人们对APX的生理生化功能做了大量研究。Yoshimura等人发现，菠菜在受到强光或甲基紫精(methylviologen, MV)处理后，体内胞质cAPX的表达水平发生明显上调[8]。Murgia等人研究发现，过表达拟南芥类囊体膜tAPX基因能够提高植物抵御MV引起的氧化伤害[9]。Sun等将番茄中的tAPX基因转入烟草中，转基因烟草显示出对盐、甘露醇等渗透胁迫的抗性[10]。综上所述，我们可以看出，APX基因可使植物更好地保护自身免受外界环境造成的氧化伤害。

甜椒、番茄和黄瓜是我国北方地区设施栽培的主要蔬菜，春秋两季易遭受低温引发的伤害，因此深入探索和研究冷敏感作物的胁迫抗性机制，有助于培育优质的蔬菜品种。

本研究以前期已分离到的LeAPX基因为模板, 将其构建到原核表达载体pET-30a(+)上, 在大肠杆菌中诱导表达并纯化，获得LeAPX融合蛋白抗体, 并对其在胁迫处理下的表达水平做了相关研究，为将来APX在番茄中的抗氧化研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

植物材料：番茄品种‘中蔬六号’。

载体和菌株：克隆载体购于大连宝生物公司；原核表达载体pET-30a、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21均由本实验室保存。

PCR引物：由上海英俊生物技术有限公司合成。

主要试剂：高保真PCR酶-KOD-Plus购于东洋纺(上海)生物科技有限公司；限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ，T4DNA连接酶购于大连宝生物公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于博奥(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1原核表达载体的构建

原核表达特异引物序列为：

LeAPX-Y-F；5′- AACTGAGCAACCTTGGT -3′；

LeAPX-Y-R；5′- ATAGTTCGTCGGGAGAG-3′。

引物扩增得到APX编码区序列，将其亚克隆到pMD18-T上，酶切目的片段后与原核表达载体pET-30a连接，转化大肠杆菌，挑取单菌落测序。

1.2.2E.coliBL21原核表达的诱导

原核表达载体pET-APX转化大肠杆菌BL21，菌液培养至对数生长期后，用IPTG诱导，每隔1 h收集菌液备用。

1.2.3APX抗体的制备

在最优条件下大量表达重组蛋白，超声波破碎后，离心收集菌体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后，切下诱导条带，放入到离心管中，液氮研碎，溶于缓冲液中，免疫小鼠；总共分4次免疫小鼠，采用皮下注射，免疫结束后，对小鼠采取眼球取血的方式收集血清。

1.2.4APX抗体的Western杂交

提取番茄叶片总蛋白进行SDS-PAGE，通过半干转移法将蛋白转印于PVDF膜上。膜在甲醇溶液中浸泡后，用封闭液(PBS)封闭1 h后，将印迹膜放入APX多克隆抗体作为一抗的溶液中孵育1 h，将印迹膜在PBS中漂洗3次，每次10 min。 将印迹膜放入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中孵育1 h后，将印迹膜在PBS中漂洗3次，每次10 min。最后将印迹膜放入洁净容器中，放入预先配制的底物显色液，室温避光显色。

2结果与分析

2.1原核表达载体的构建

为研究APX在蛋白水平上的表达，将之前分离到的LeAPX基因(GenBank注册号：AK319984)的编码区正向插入到pET-30a(+)中，构建了pET-LeAPX表达载体。启动子是T7，酶切位点分别是EcoRI和SalI(图1)。

2.2原核表达载体的酶切鉴定和聚丙烯酰胺凝胶电泳

将构建好的pET-LeAPX转化大肠杆菌BL21，菌液PCR和酶切鉴定一样，有1 200 bp左右的条带(图2)，与LeAPX基因编码区长度符合。菌液经IPTG诱导后，电泳检测发现1条约为55 kD左右的条带(图3)。

2.3APX蛋白的表达分析

Western杂交分析表明，APX蛋白在50 mmol·L-1H2O2处理时，表达量发生下调；NaCl处理下，蛋白水平没有发生显著变化；20% PEG处理后，APX蛋白表达明显发生上调，12 h后达最高值；4 ℃处理下，APX蛋白也发生显著变化，6 h后达到一个高峰，随后有所下降(图4)。

3讨论与结论

植物生存在一个多变环境中，时常会受到低温、高温、干旱和盐渍等非生物胁迫的影响。这些都会导致细胞内ROS的大量积累，进而会破坏与光合电子传递有关的色素蛋白复合体、类囊体膜上的脂类以及卡尔文循环中的某些酶等，使叶绿素发生降解，导致光合作用下降。大量研究表明，APX的过量表达可以提高植物对氧化胁迫的耐性，有效地清除体内的H2O2，维持植株的正常生长发育。因此通过基因工程手段进行APX基因的遗传操作可改良农作物的品质和抗性。近年来，有关APX研究已不断扩展和深入，研究人员陆续在植物体内鉴定出一系列APX基因。

本研究在前期工作的基础上构建了APX基因的原核表达载体，重组蛋白经诱导表达纯化后，制备了APX的多克隆抗体。为了探索APX在蛋白水平上的表达模式，番茄植株分别进行了干旱、低温、氧化和高盐胁迫处理。Western杂交表明，低温、干旱条件下，APX蛋白水平显著上调，高盐处理下，APX蛋白水平基本保持不变，出乎意料的是，H2O2下调其蛋白的表达，与Sun等[11]转录水平结果截然相反，造成这样的结果可能有两个原因：一是氧化胁迫的时间点是否合适，是否随着时间的延长，蛋白水平的表达会呈现上升的趋势；二是或许植物体内APX存在着其它调控机制，影响APX蛋白的同步表达，Mittler等[12]曾证明胞质型APX属于转录后调控。转录和翻译的不一致有待后期工作的进一步研究，可通过人为加入抑制剂来调控转录和翻译进而检测其表达水平的变化。

参考文献

[1]马永.活性氧的化学发光研究及其在分析化学中的应用[D]. 北京：北京化工大学, 2008.

[2]Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1999, 50: 601-640.

[3]Jiang M, Zhang J. Effect of abscisic acid on active oxygen species, antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings[J]. Plant and Cell Physiol, 2001, 42(11): 1265-1273.

[4]Zhao L, Deng X, Shan L. The response mechanism of active oxygen species removing system to drought stress[J]. Acta Bot Boreali-occidentalia Sinica, 2004, 25(2): 413-418.

[5]Imlay J A, Linn S. DNA damage and oxygen radical toxicity[J]. Science, 1988, 240(4857): 1302-1309.

[6]Chen S Y. Membrane lipid peroxidation damage in plant cell[J]. Plant Physiol Comm, 1991, 27(2): 84-90.

[7]廖祥儒,王越. 叶绿体内活性氧产生及清除的酶系统[J]. 生命的化学, 2000，20(6): 260-262.

[8]Yoshimura K, Yabuta Y, Ishikawa T, et al. Expression of spinach ascorbate peroxidase isoenzymes in response to oxidative stresses[J]. Plant Physiol, 2000, 123(1):223-233.

[9]Murgia I, Tarantino D, Vannini C, et al. Arabidopsis thaliana plants overexpressing thylakoidal ascorbate peroxidase show increased resistance to Paraquat induced photooxidative stress and to nitric oxide induced cell death[J]. The Plant J, 2004, 38(6): 940-953.

[10]孙卫红,莫明辉,孙兰兰，等. 过量表达StAPX的烟草在百草枯诱导的氧化胁迫下的表现[J]. 现代农业科技, 2011(11): 13-15.

[11]Sun W H, Duan M, Shu DF, et al. Over-expression ofStAPXin tobacco improves seed germination and increases early seedling tolerance to salinity and osmotic stresses[J]. Plant Cell Rep, 2010, 29(8): 917-26.

[12]Mittler R, Zilinskas BA. Regulation of pea cytosolic ascorbate peroxidase and other antioxidant enzymes during the progression of drought stress and following recovery from drought[J]. Plant J, 1994, 5(3): 397-405.

(编辑：武英耀)

Expression analysis of LeAPX

Duan Ming1, Wang Xingchun2,Yuan Xuzhao3

(1.Experimentalandteachingcenter,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；2.CollegeofLifeSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；3.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Key words:Tomato; Expression analysis;APXgene

Abstract:APX is one of the important antioxidative enzymes in plant. It plays a key role in the resistance of plants to oxidative stress in the external environments. In order to study its function, we used tomato as material,APXgene which cloned before was constructed in the prokaryotic expression vector pET-30. After being induced and expressed, the fusion protein were used to prepare for antibody and Western-blot analysis. The results showed APX were induced by low temperature and PEG, in line with the patterns of gene expression, but was not induced by NaCl; After H2O2spraying treatment, the level of APX appeared to decline, which display different pattern from that of the gene expression. There could be a mechanism of post-transcriptional regulation, which could be explored in future.

收稿日期：2016-03-04 修回日期：2016-03-29

作者简介：段明(1984-),男(汉)，山东威海人，博士，讲师，研究方向：植物抗逆分子生物学

基金项目：山西省青年科技研究基金(2015021142)；山西农业大学科技创新基金(20142-12)；山西农业大学博士启动基金(2013YJ44)

中图分类号：Q78

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)06-0387-04