马芳芳，苏彦冰，张彬，李红英，韩渊怀

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原 030031)



玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

马芳芳1，2，苏彦冰1，2，张彬1，2，李红英1，2，韩渊怀1，2

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原 030031)

摘要：为克隆玉米(ZeamaysL.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI，并进行序列分析和原核表达研究，根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物，以玉米叶片总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增得到了约750 bp的基因编码区cDNA片段，T/A克隆后进行了序列测定及序列分析，随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上，得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示，玉米ZmTPI(GenBank：EU959275)cDNA全长1 216 bp，753 bp开放阅读框编码250个氨基酸，推测分子量26.7205 kDa，理论等电点为5.12；该蛋白具有高度保守的TIM结构域，与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性；进化树分析表明，玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近，处于同一进化支；SDS-PAGE检测结果显示，成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功，为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。

关键词：玉米； 磷酸丙糖异构酶； 基因克隆； 原核表达

磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase，TPI)能够催化二羟丙酮磷酸(DHAP)和D型甘油醛-3-磷酸(GAP)这两种丙糖磷酸异构体之间的可逆转换[1,2]，作为糖酵解及糖异生途径中的关键酶，TPI被发现几乎存在于所有的生物体当中[3,4]。光合生物的TPI通常含有两种亚型，分别存在于细胞质和叶绿体中。位于细胞质的胞质型TPI(cTPI)参与糖酵解，而位于叶绿体的质体型TPI(pTPI)则参与了卡尔文循环[5]。在蛋白质组学研究中，TPI经常被鉴定为是谷胱甘肽化和亚硝基化的潜在靶标，表明它的活性在胁迫条件下可以通过半胱氨酸修饰进行调节[6～10]。由于TPI在植物生长发育过程中对于能量的有效生成是必不可少的，近年来国内外关于TPI相关功能的研究备受关注。目前来自不同生物的TPI结构特点和功能已经被广泛研究[11～15]。Dorion等研究发现在马铃薯生长过程中，叶片cTPI对于生物合成过程中能量的生成、碳的代谢等方面起着重要的作用[16]。Salekdeh等通过蛋白质组学分析结果表明水稻TPI在干旱胁迫条件下，其表达量上调了30%～40%[17]。Ito 等认为拟南芥TPI 作为谷胱甘肽化靶酶在糖代谢途径中起到关键调控作用[7]。课题组前期研究工作中，通过酵母双杂交技术筛选玉米叶片cDNA文库，发现了一个与ZmMPK5相互作用蛋白(未发表的数据)，经鉴定该蛋白属于玉米胞质型TPI(GenBank：EU959275)，本文命名为ZmTPI。推测该蛋白可能与ZmMPK5相互作用，在植物的生长发育及代谢过程中起作用。目前国内外关于玉米TPI的研究鲜有报道，本研究以获得的ZmTPI序列为基础，拟通过对该蛋白进行基因克隆、序列分析以及原核表达及纯化，为进一步探索研究玉米TPI 的生理生化功能奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1植物材料

以玉米(ZeamaysL.)杂交种农大108为材料，将种子浸泡12 h，25 ℃催芽48 h后播于含有营养液的沙土中培养，当幼苗第二片真叶完全展开时，剪取第二片叶，迅速置于液氮中冷冻保存。

1.1.2菌株和载体

大肠杆菌菌株E.coli DH5α、Bl21由本实验室保存；pMD19-T Vector购自TaKaRa宝生物(大连)生物工程有限公司； pGEX-4T-1(Novagen, Inc., Madison, WI, USA)由本实验室保存。

1.1.3主要试剂

氨苄青霉素、IPTG为Sigma公司产品；DNA polymerase、DNA分子量标准、DNA快速回收纯化试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；PlatinumPfxDNA Polymerase购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa宝生物(大连)生物工程有限公司；High-Affinity GST Resin购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2ZmTPI基因的克隆

根据NCBI数据库中ZmTPI基因(序列号：ACG31393)的全长cDNA序列，设计并合成引物：TPI-F：5′-GAATTC ATGGGCCGCAAGTTCTTCGT-3’；TPI-R：5’-CTCGAGCACGGTGGCGGCGTTGATGAT-3’。为了便于后续载体的构建，引物设计时分别在正、反向引物中添加了EcoRI和XhoI酶切位点(下划线部分)。

提取玉米叶片总RNA，并进行反转录反应合成cDNA。利用上述引物并以合成的cDNA为模板扩增ZmTPI的编码区(ORF)片段。PCR反应条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72 ℃，50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。将得到的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳进行检测，切取目的条带进行胶回收与产物纯化。纯化产物与pMD19-T载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，送至上海生工生物技术有限公司测序。将测序结果正确的重组质粒命名为 T-ZmTPI。

1.3ZmTPI序列分析

基因核苷酸和氨基酸同源序列的查找和比对主要在NCBI、ExPASy等数据库中进行，采用BLAST程序完成；氨基酸、蛋白分子量、等电点分析由ExPASy在线分析软件ProtParam完成；结构域分析由Pfam在线分析软件完成；多序列比对由CLUSTAL-X软件结合BOXSHADE在线工具完成；聚类分析由MEGA 3软件完成，采用Neighbor-joining方法进行1 000次Bootstrap重复检测。

1.4ZmTPI原核表达载体的构建

分别将重组质粒T-ZmTPI和载体质粒pGEX-4T-1进行EcoRI和XhoI双酶切，酶切产物经电泳后回收ZmTPI目的片段以及载体大片段，经连接反应，使ZmTPI片段插入到pGEX-4T-1的相应酶切位点之间。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化子经筛选、鉴定并测序后，获得含有ZmTPI编码区插入方向和阅读框均正确的重组原核表达载体，命名为GST-ZmTPI。

1.5融合蛋白的表达及纯化

表达：将构建好的重组质粒GST-ZmTPI，转化大肠杆菌BL21感受态；挑单克隆于5 mL LB培养基中，37 ℃摇菌过夜；按1∶100比例接种于50 mL LB培养基中，37 ℃培养2～3 h，至OD600约0.6。加入IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1，28 ℃诱导培养一定的时间(2 h、4 h 、6 h)；4 ℃，8 000 r·min-1离心5 min，收集菌体，加入3 mL 预冷的PBS(PH 7.5)重悬；超声破碎细胞壁，至菌体悬液由混浊变为澄清(破壁前，在细胞悬液中加入PMSF至终浓度为1 mmol·L-1)；4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，收集上清，吸取适量用于SDS-PAGE检测蛋白表达情况。

纯化：参照High-Affinity GST Resin说明书，将上述收集的GST-ZmTPI融合蛋白细胞裂解液上清加入亲和层析柱，与1 mL 50% Glutathione Sepharose轻柔混匀后， 4 ℃孵育结合，之后用20倍柱床体积的PBS洗去未结合蛋白，用10倍柱床体积的新鲜配置的还原型谷胱甘肽洗脱液进行洗脱；即为纯化后的融合蛋白。取适量洗脱液，加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴煮5 min，跑SDS-PAGE，检测蛋白纯化情况。

2结果与分析

2.1ZmTPI基因的克隆

提取玉米叶片总RNA，并进行反转录反应合成cDNA。以cDNA为模板并利用设计的特异引物扩增ZmTPI的编码区(ORF)片段。将得到的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1，可以看到在753 bp位置有一条单一目的条带，与预期结果相符。切取目的条带进行胶回收与产物纯化，纯化产物与pMD19-T载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，送至上海生工生物技术有限公司测序。测序结果表明，得到了与预期结果相符的序列正确的重组质粒，并将其命名为T-ZmTPI。

2.2ZmTPI序列分析

ZmTPI(序列号：ACG31393)cDNA全长1 216 bp，753 bp的开放阅读框(ORF)编码250个氨基酸残基，推测相对分子质量为26.7205 kDa，等电点为5.12。具有完整的TIM保守功能域，属于TIM phosphate binding超家族成员。

利用Clustal X软件结合BoxShade在线工具，将ZmTPI与其它植物TPI蛋白进行氨基酸多序列比对分析(图2)，每一个序列中都含有TIM的催化残基，即酶的活性中心(Asn 10, Lys 12, His 96, Glu 166)，以及保证底物与活性中心紧密结合的特征保守基序(164-AYEPVWAIGTG-174)。玉米ZmTPI与其它植物的TPI蛋白具有非常高的相似性，与甘蔗的TPI同源性高达到93%，与水稻、小麦、马铃薯、拟南芥、大豆的TPI蛋白分别有87%、86%、84%、81%、81%的同源性。

为了研究ZmTPI蛋白氨基酸序列与其它植物TPI蛋白系统发育的关系，本文选取Genbank中一些已知的ZmTPI同源氨基酸序列，利用MEGA 3软件构建了系统发育进化树(图3)。结果显示，玉米ZmTPI与甘蔗、水稻、大麦等的亲缘关系较近，与菠菜的亲缘关系较远，符合物种进化规律。

2.3ZmTPI原核表达载体的构建

为了进行原核表达试验，分别将重组质粒T-ZmTPI和载体质粒pGEX-4T-1进行EcoRI和XhoI双酶切，酶切产物经电泳后回收ZmTPI目的片段以及载体大片段，经连接反应，构建重组质粒。EcoRI和XhoI双酶切鉴定结果表明(图4)，在753 bp左右目的条带位置切出了与预期结果相符的单一片段，说明ZmTPI的ORF片段已成功插入到载体pGEX-4T-1的相应酶切位点之间。测序结果也表明，ZmTPI编码区在载体中的插入方向以及读码框均正确，说明已成功构建可以融合表达GST标签的重组质粒GST-ZmTPI。

2.4融合蛋白的表达及纯化

将构建好的GST-ZmTPI重组质粒转化大肠杆菌Bl21，经28 ℃，0.1 mmol·L-1IPTG诱导表达2 h、4 h 、6 h后将细菌裂解液进行SDS-PAGE，检测其表达情况，结果如图5 (a) 显示，在约53 kD左右的位置处形成一深染蛋白条带，与预期的GST-ZmTPI融合蛋白大小基本一致(其中GST标签蛋白为26 kD，ZmTPI推测分子量约27 kD，因此诱导出的目的融合蛋白的分子量为GST蛋白与ZmTPI蛋白的分子量之和)。并且随着时间的延长，融合蛋白的表达量也有逐渐增加的趋势。诱导表达6 h后，最终收集菌体，经超声破碎后收集上清，通过亲和层析柱，利用GST和还原型谷胱甘肽(GSH)之间酶-底物的特异性亲和作用对细菌裂解液中的GST-ZmTPI融合蛋白进行纯化，结果如图5 (b) 显示，在目的位置得到唯一的一条蛋白条带，说明纯化效果理想。

3讨论与结论

磷酸丙糖异构酶在原核生物和真核生物中普遍存在，并且在糖酵解、糖异生、脂肪酸合成以及戊糖磷酸途径等途径中起着关键作用。TPI通常被认为是一个极其高效的酶，甚至被称为是一个完美的催化剂[2]。TPI的缺乏或酶活性的降低可以导致机体一系列生理及代谢上的改变[18]。在人类中，基因突变引起的中度至重度TPI活性下降可导致溶血性贫血及急性进行性神经系统功能障碍[19]。拟南芥pTPI基因缺失突变体pdtpi，由于积累的DHAP导致甲基乙二醛的毒害而表现出严重的生长发育受阻，表明质体型TPI在幼苗生长过程中的叶绿体发育以及从自养到异养的代谢转变过程中发挥重要功能[20]。Dorion等对转基因马铃薯根的研究结果表明，胞质TPI的大量减少改变了植物初级代谢过程中碳的分布情况[21]。TPI很可能在植物受到胁迫时也起到重要的作用，已有研究表明cTPI与蕨类植物蜈蚣草的砷抗性相关[22]，缺铁胁迫条件下拟南芥TPI可以被诱导表达[23]。然而在玉米中，关于TPI的研究鲜有报道。

实验室前期通过筛选玉米叶片酵母双杂交cDNA文库，得到了玉米中的一个胞质型TPI(GenBank：EU959275)，为了深入了解它的生化特性及功能，我们在获得玉米TPI基因cDNA全长序列的基础上设计特异引物，以玉米叶片总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增得到了约750 bp的与预期大小相符的基因编码区cDNA片段，T/A克隆后进行了序列测定。结果显示，成功克隆了玉米ZmTPI。该基因753 bp开放阅读框编码250个氨基酸，推测分子量26.720 5 kDa，理论等电点5.12。

真核生物的TPI起源于α-变形菌，具有较高的保守性，被广泛应用于物种间基因的起源与进化研究[24,25]。本研究利用生物信息学软件对ZmTPI进行了多序列比对分析，发现该蛋白氨基酸序列具有典型的高度保守的TIM功能结构域，与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性，并且具有TIM 所共有的活性中心氨基酸及保守基序。进化树分析结果显示，玉米ZmTPI与甘蔗的亲缘关系最近，处在同一进化枝，与菠菜的亲缘关系较远，符合物种进化规律。序列比对及进化树分析，使我们可以对不同物种TPI同源基因起源进化的相互关系以及可能行使的功能做一定的预测，为进一步研究该基因分子调控机理提供理论依据。

通过表达克隆基因所编码的蛋白质，能够为我们探索和研究该基因的结构与功能提供基础。本研究将ZmTPI克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中，构建了重组质粒GST-ZmTPI，转化大肠杆菌Bl21，经IPTG诱导表达出与预期大小基本一致的GST-ZmTPI融合蛋白。通过亲和层析柱，对细菌裂解液中的GST-ZmTPI融合蛋白进行了纯化，得到了纯化效果理想的目的蛋白，为研究其生化特性提供了材料。

综上所述，本研究从玉米叶片中成功克隆了ZmTPI基因编码区序列并对该序列进行了分析。同时成功构建了GST-ZmTPI 重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白，并对该融合蛋白进行了纯化，为下一步深入研究ZmTPI的理化性质及生物学功能提供了基础。

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(编辑：马荣博)

Cloning and prokaryotic expression ofTPIgene in maize

Ma Fangfang1,2, Su Yanbing1,2, Zhang Bin1,2, Li Hongying1,2, Han Yuanhuai1,2

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China)

Key words:Maize； Triosephosphate isomerase； Gene cloning； Prokaryotic expression

Abstract:ZmTPIgene cloned fromZeamayswas expressed inE.coliBl21. In this work, based on the full-length cDNA sequences of maizeTPIgene, a cDNA coding region fragment about 750 bp was amplified using RT-PCR method from total RNA of maize leaves and cloned into the prokaryotic expression vector PGEX-4T-1, resulting the recombinant plasmid of GST-ZmTPI. The resulting construct GST-ZmTPI was then transformed intoE.coliBl21 for further analysis. Results showed that theZmTPI(GenBank: EU959275) cDNA sequence is 1 216 bp in length and has an open reading frame (ORF) of 753 nucleotides, encoding a protein of 250 amino acids with a predicted molecular mass of approximately 26.7205 kDa polypeptide and an isoelectric point of 5.12; The ZmTPI protein has highly conserved TIM domain, and was highly similar with its homologous proteins in other plants; phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequence of ZmTPI was most similar to that ofSaccharumofficinarum, indicating that they belong to the same evolutionary branch; SDS-PAGE assay showed that the fusion protein was successfully expressed and purified with the expected size. TheZmTPIgene was cloned and successfully expressed and purified inE.coliBl21. This study will provide a foundation for further research on biological function of this protein.

收稿日期：2016-03-16 修回日期：2016-04-01

作者简介：马芳芳(1984-)，女(回)，山西长治人，讲师，博士，研究方向：植物逆境生理和分子生物学

基金项目：山西农业大学博士启动基金(2013YJ04)；山西农业大学科技创新基金(2014022、2014YZ2-5)

中图分类号：S513；Q78

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)06-0381-06