潘　文，韩　伟，姜国华，郝霖雨（.中牧实业股份有限公司中牧研究院农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室，北京海淀00070；.中国农业科学院生物技术研究所，北京海淀0008）



猪乙脑传代细胞活疫苗（SAl4-14-2株）对仔猪的安全性试验

潘文1，韩伟1，姜国华2，郝霖雨1
（1.中牧实业股份有限公司中牧研究院农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室，北京海淀100070；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京海淀100081）

摘要：评价以Vero细胞为基质的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）对仔猪的安全性，将猪乙脑传代细胞活疫苗，通过1次超剂量（10倍剂量）免疫40～45日龄的仔猪，同时设立病毒液组、冻干保护剂组、空白对照组，监测仔猪体温和临床症状，采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血浆，仔猪于免疫后第14天无菌取脑组织。对采集的血样及脑组织进行蚀斑检测，并对血样及脑组织盲传3代的细胞培养液进行RT-PCR检测。结果，试验猪免疫前后临床观察、体温，免疫后接种部位均未见异常。蚀斑法和RT-PCR法检测各试验组仔猪血浆和脑组织提取液均未检出乙脑病毒。表明以Vero细胞为基质的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）对仔猪是安全的。

关键词：流行性乙型脑炎；SA14-14-2减毒株；Vero细胞；疫苗；安全性

流行性乙型脑炎（乙脑）是由乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种蚊媒性人兽共患的传染病。猪群感染最为普遍，怀孕母猪可表现为高热、流产、死胎和木乃伊胎，公猪则出现睾丸炎。乙脑病毒主要存在于中枢神经系统、脑脊液、血液和死胎仔猪的脑组织中。

目前，我国用于预防猪乙脑感染的疫苗主要是猪乙型脑炎减毒活疫苗（SA14-14-2株）。该疫苗采用原代地鼠肾细胞作为病毒培养基质，生产中存在地鼠来源紧张、生产成本高、产量低、外源因子多、批次差异大等缺点。

1995年，世界卫生组织（WHO）推荐Vero细胞可作为生产疫苗的细胞基质。以Vero细胞为基质生产的疫苗均显示出了良好的安全性和免疫原性，1998年，Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗（P3株）被批准上市，用于人类乙脑的免疫接种，研究以Vero细胞为基质的猪乙脑活疫苗（SA14-14-2株）也将具有较好的应用前景。

本试验通过一次超剂量免疫40～45日龄的仔猪评价以Vero细胞为基质的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）的安全性，为SA14-14-2株猪乙脑传代细胞活疫苗的研制提供了试验基础。

1　材料

1.1细胞、病毒、血清BHK-21细胞、Vero细胞株，均购自于中国兽医药品监察所。

乙脑病毒液，是用Vero细胞将乙脑SA14-14-2株传至F10代的病毒液，病毒含量为6.20 log PFU/mL。阳性对照，是用BHK-21细胞将乙脑SA14-14-2株培养至F7代的病毒液。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪伪狂犬病病毒（PRV），均由中国农业科学院生物技术研究所姜国华老师提供。

1.2主要试剂及培养基DMEM、MEM为Gibco公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；水解乳蛋白、胰酶、甲基纤维素、肝素纳、结晶紫，均为Sigma公司产品。Qiagen onestep RT-PCR Kit、DNA Ladder Marker、Nuclease Inhibitor、Trizol试剂为Qiagen公司产品。猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒为武汉科前动物生物制品有限责任公司产品。

1.3试验动物40～45日龄乙脑抗体阴性健康易感仔猪。

2　方法

2.1试验猪的筛选及分组对140只30日龄的仔猪分别进行乙脑ELISA抗体检测试剂盒检测和血凝抑制试验，筛选乙脑抗体双阴性健康仔猪。试剂盒检测按照试剂盒说明书操作，血凝抑制试验按照“SNT1445-2004动物流行性乙型脑炎微量血凝抑制试验”操作。

取筛选获得的乙脑抗体双阴性健康仔猪分为4组，耳后肌肉注射，每组5头。第1组每头猪注射10倍剂量猪乙脑传代细胞活疫苗；第2组每头猪注射10倍剂乙脑病毒液；第3组每头猪注射10倍剂量（10 mL）冻干保护剂；第4组为空白对照组，不免疫。

2.2临床观察与样品采集免疫前，观察仔猪5 d，每天饲喂前测量体温。免疫后观察14 d，每天饲喂前测量体温；采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血浆，仔猪于免疫后第14天剖杀，无菌取脑组织。

2.3血浆和脑组织的蚀斑检测将各试验组仔猪的血浆样本和脑组织提取液分别接种BHK-21细胞单层，并用DMEM甲基纤维素半固体培养基于37℃覆盖培养3～4 d，经固定及染色后，若出现病毒蚀斑，且经乙脑病毒特异性鉴定（标准血清中和培养法）为阳性，即判定血浆样本和脑组织提取液乙脑病毒检测为阳性，否则为阴性。

2.4血浆和脑组织盲传3代的细胞培养液的RTPCR检测

2.4.1JEV-RNA模板的制备按照RNA提取方法[1]提取血浆和脑组织盲传3代细胞培养液中的乙脑病毒RNA。

2.4.2引物合成根据“GB/T 22333-2008日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验”方法中公布的引物基因序列，由北京三博远志生物科学技术有限公司合成引物。

2.4.3RT-PCR反应用Qiagen一步RT-PCR试剂盒配套缓冲液及酶体系，反应液体系（25 μL）为：5×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上下游引物3 μL，混合酶液1 μL，5-Q solution 5 μL，RNAse inhibitor 0.3 μL，RNA模板9.7 μL。反应程序为50℃30 min，95℃预变性15 min；94℃0.5 min，50℃0.8 min，72℃1 min，40个循环，最后72℃延伸10 min。

2.4.4特异性检测用RT-PCR方法扩增JEV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV等病毒，检测该方法的特异性。

2.4.5敏感性检测将乙脑病毒液进行10倍倍比稀释后，提取RNA，进行RT-PCR检测扩增，评价该方法的敏感性。

2.5RT-PCR检测血浆和脑组织盲传3代的细胞培养液血浆和脑组织提取液检测为乙脑阴性的样本，用含2%小牛血清DMEM培养基于BHK-21细胞单层中，35℃条件下连续盲传3代后用RT-PCR方法进行检测。

3　结果与分析

3.1试验猪的筛选结果对140只30日龄的仔猪分别进行乙脑ELISA抗体试剂盒检测和血凝抑制试验，筛选出25头乙脑抗体双阴性健康仔猪，乙脑抗体双阴性检测率为17.86%，取其中20头仔猪用于试验。

3.2试验猪体温、临床观察结果试验期间，试验猪体温均保持在37.0℃～39.5℃之间，免疫后未见试验猪体温升高至40℃以上，且接种部位均未见异常，临床状态观察，采食、精神状态均正常。

3.3血浆和脑组织的蚀斑检测蚀斑法检测各试验组仔猪血样均未检出病毒血症，仔猪脑组织提取液病毒检测均为阴性（表1）。

表1　血浆和脑组织的蚀斑检测结果

图1　RT- PCR检测J EV的特异性结果M：600 bp DNA ladder Marker；1：猪传染性胃肠炎病毒；2：猪瘟病毒；3：猪繁殖与呼吸综合征病毒；4：猪伪狂犬病病毒；5：猪乙型脑炎病毒；6：空白对照

3.4RT-PCR检测JEV的特异性检测JEV，可扩增到与预期大小相符的375 bp的特异性目的片段，而对PRRSV、CSFV、PRV、TGEV等病毒进行检测，均未检出特异性条带（见图1）。3.5 RT-PCR检测JEV的敏感性将已知病毒含量的乙脑病毒液，进行10倍倍比稀释，RT-PCR可检出的最高稀释滴度为10-4。经计算本试验采用RT-PCR法检测的最低JEV病毒粒子约为55个，如图2所示。

图2　RT- PCR检测J EV的敏感性结果M：600 bp DNA ladder Marker；1：10-5稀释度；2：10-4稀释度；3：10-3稀释度；4：10-2稀释度；5：10-1稀释度；7：毒价为6.2 log PFU/mL的乙脑毒液

3.6RT-PCR检测血浆和脑组织盲传3代的细胞培养液RT-PCR检测血浆和脑组织盲传3代的细胞培养液结果均为阴性，与上述3.3结果一致。图3为RT-PCR检测乙脑疫苗免疫组5头仔猪脑组织盲传3代的细胞培养液的结果。

图3　RT- PCR检测乙脑疫苗免疫组5头仔猪脑组织盲传3代的细胞培养液结果M：600 bp DNA ladder Marker；1-5：分别为乙脑疫苗免疫组5头仔猪脑组织盲传3代的细胞培养液；6：阳性对照BHK-21培养的SA14-14-2 F7代毒液；7：空白对照

4　讨论

SA14-14-2株原代地鼠肾细胞乙脑减毒活疫苗能诱导产生体液和细胞双重免疫应答[2]，注射针次少，副反应低，效果明显优于灭活疫苗，已在国内外广泛应用并证明十分安全[3-5]，但考虑实际疫苗生产过程中培养基质的均一性和疫苗质量的可控性、安全性等问题，选择Vero细胞进行疫苗生产具有更大的优势，目前国内兽医领域还未见以Vero细胞为基质制备猪乙脑活疫苗（SA14-14-2株）的报道，本试验以Vero细胞为基质制备了猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株），并在40～45日龄仔猪上进行了该疫苗的安全性研究。

仔猪接种后，免疫组、病毒液组均未形成由猪乙脑SA14-14-2株引起的病毒血症，仔猪脑组织中也未检测出乙脑病毒，免疫组、病毒液组、耐热保护剂组的仔猪注射部位及临床症状均未见异常反应，说明SA14-14-2株乙脑病毒进入猪体后未引发猪乙脑相关的病症，且活疫苗中的细胞基质、保护剂配方等成分对仔猪是安全的。

本试验除了使用传统的“蚀斑法”对血浆和

脑组织进行乙脑病毒检测外，还对血样及脑组织盲传3代的细胞培养液进行了RT-PCR检测，RT-PCR方法不仅简便、快捷，还具备敏感性高，特异性强的优点，可以大大提高检样的效率。

本试验后续开展的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）的免疫原性等其他相关试验必将为猪乙脑的防控带来积极的影响。

参考文献：

[1]高正琴，岳秉飞，贺争鸣.乙脑病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[J].药物分析杂志，2010，30（10）：1928-1931.

[2]李茂光，俞永新，刘欣玉.SA14-14-2株流行性乙型脑炎减毒活疫苗与灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的比较研究[J].中国疫苗和免疫，2010，16（4）：334-339.

[3]俞永新.流行性乙型脑炎减毒活疫苗的发展和应用[J].上海预防医学，2006，18（3）：110-112.

[4]俞永新.基于SA14-14-2减毒株的新型乙型脑炎疫苗的研究进展[J].中国病毒病杂志，2012，2（3）：161-167.

[5]许乐燕，徐闻青，徐帆洪.乙型脑炎病毒SA14-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性[J] .中国生物制品学杂志，2008，21（10）：833-837.

Thesafety test of the J E live SA14- 14- 2 vaccinegrown on VERO cells in piglets

PAN Wen1，HAN Wei1，JIANG Guo-hua2，HAO Lin-yu1
（1.Zhongmu Institute，China Animal Husbandry Industry CO.LTD，Beijing 100070，China；2.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：To evaluate the safety of the epidemic encephalitis（JE）live（SA14-14-2）vaccine prepared using VERO cells in piglets.Ten time doses of JE live SA14-14-2 vaccine，JE virus，and protectant were inoculated in five 40-45-day-old piglets，respectively.Meanwhile blank control was set up.The piglets body temperature was measured and clinical status was observed everyday.Blood plasma samples were collected before immunization and after immunization at day 1，2，3，5，and 7.The whole brain tissue was sterilely separated at day 14 post-immune challenge.JE virus in plasma and brain tissue was detected by plaque-forming test. JE virus in three blind passages of plasma and brain cultivated on BHK-21 cells were detected by RT-PCR test.The clinical observation and body temperature of piglets before and after immunization，and vaccination site after immunization showed no abnormalities. JE virus in plasma and brain tissue was not detected by plaque-forming test and RT-PCR test.JE live SA14-14-2 vaccine cultivated on VERO cells is safe for piglets.

Key words：J E；SA-14-14-2 attenuated virus strain；VERO cells；vaccine；safety Corresponding author：HAO Lin-yu

通讯作者：郝霖雨，E-mail：hly29@sohu.com

作者简介：潘文（1985-），女，硕士，主要从事动物疫苗研发工作，E-mail：Pstone1985@163.com

收稿日期：2014-03-21

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0031- 03