宋丽聪，王黎霞，刘新月，赵晨璐，张建军，安　健（.北京农学院动物科学技术学院，北京昌平006；.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京房山044）



柔嫩艾美耳球虫裂殖子对侵入细胞凋亡抑制通路的研究

宋丽聪1，王黎霞2，刘新月1，赵晨璐1，张建军1，安健1
（1.北京农学院动物科学技术学院，北京昌平102206；2.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京房山102442）

摘要：为了研究柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenlla）裂殖子入侵宿主细胞后对凋亡诱导的抑制通路，将纯化的裂殖子与牛肾传代细胞（MDBK细胞）共培养1.5 h。用含6%乙醇的完全培养基诱导细胞凋亡2.5 h，通过流式细胞术检测细胞凋亡率。采用标准试剂盒测定Cyto C，Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性。流式细胞术结果显示，入侵裂殖子的细胞在诱导凋亡后其凋亡率为4.57%，而未感染的细胞其凋亡率达到23.69%，二者差异显著（P＜0.05），诱导凋亡的MDBK细胞早期凋亡率为19.50%，晚期凋亡率为4.19%，而感染裂殖子后诱导凋亡的MDBK细胞其早期凋亡率为3.53%，晚期凋亡率为1.04%，差异显著（P＜0.05）。结果表明，裂殖子的入侵不但可以抑制细胞凋亡，还可以延缓细胞进入早期凋亡的时间。试剂盒结果表明，裂殖子使Cyto C，Caspase8，Caspase9的活性下降，而Caspase3没有变化。根据上述结果初步判断，E. tenlla裂殖子抑制MDBK细胞的凋亡是通过线粒体通路。

关键词：柔嫩艾美耳球虫；裂殖子；MDBK细胞；细胞凋亡；通路

鸡球虫病是一种由原生动物门寄生虫引起的疾病，严重影响着家禽的饲料转化率，全球每年因为球虫病造成的经济损失约2.4亿美元[1]。深入研究球虫与入侵宿主细胞的相互关系，可以为研制新型抗球虫疫苗和治疗药物奠定基础。

研究表明，弓形虫能通过阻断不同的凋亡信号级联放大反应来抑制宿主细胞凋亡，以此延长在宿主细胞内的存活时间，以便于完成生活史[2]。最新的研究表明，弓形虫等胞内寄生的原虫可以通过调节NF-KB、Caspase级联、细胞色素C、P13K-AKB信号通路抑制宿主细胞凋亡[3]。然而，球虫对宿主细胞凋亡机制的相关研究较少。目前，有研究表明，E.tenella感染可造成宿主细胞膜电位的下降以及线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放。而MPTP开放是E.tenella调节宿主细胞线粒体凋亡通路中的关键环节[4]。为了深入研究E.tenella抑制侵入细胞凋亡的机制，我们实验分离纯化E. tenlla裂殖子，使其入侵MDBK细胞，采用6%乙醇作为凋亡诱导剂，采用流式细胞术，标准试剂盒分光光度法检测裂殖子对细胞线粒体凋亡通路相关因子的变化，初步确定E.tenella抑制MDBK细胞凋亡的通路。

1　材料与方法

1.1E.tenlla BJ4株孢子化卵囊由北京农学院实验室保存，每3个月用公鸡雏复壮，宿主细胞为本实验室保存的MDBK细胞系。

1.2实验分组试验共分4组。A组：未感染球虫，未诱导凋亡；B组：未感染球虫，诱导凋亡；C组：感染球虫，未诱导凋亡；D组：感染球虫，诱导凋亡，每组3个重复样品。

1.3裂殖子分离纯化及诱导侵入细胞的凋亡

孢子化卵囊感染7日龄无球虫雏鸡，每只鸡1× 105卵囊。感染108 h捕杀试验鸡，剪开盲肠壁，在洗脱液中刮下黏膜，匀浆，游离出裂殖子。匀浆通过过滤离心除去盲肠组织块和大的杂质。加入适量洗脱液重悬，42℃水浴锅中水浴5 min。将水浴后的裂殖子重悬液加入层析柱中，收集纯化后的裂殖子。与传至第3代的MDBK细胞共培养1.5 h。用6%乙醇诱导细胞凋亡2.5 h。1.4流式细胞术检测将待测细胞浓度调整为5×105～1×106个/mL。取1 mL细胞，离心收集沉淀。将细胞重悬于200 μL Binding Buffer。加入10 μL PI和10 μL Annexin V-FITC，混匀，室温避光孵育15 min。加入300 μL Binding Buffer，上机检测。

1.5试剂盒检测Cyto C的释放量及Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性按照检测试剂盒产品说明书，使用比色法和分光光度法检测Cyto C的释放量及Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性。

1.6统计学分析数据分析采用SPSS17.0软件进行，用方差齐性检验和单因素方差分析（One Way ANOVA）进行多组间比较分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1裂殖子的纯化结果由鸡盲肠黏膜分离得到的裂殖子（图1A），含有大量的细菌，红细胞及杂质。经DE-52纤维素层析柱纯化后，收集到较为纯净的裂殖子（图1B）。

图1　裂殖子分离及纯化A：分离后未纯化的裂殖子；B：纯化后的裂殖子

2.2流式细胞术检测结果未入侵组细胞凋亡率为0.69%（图2A），入侵组细胞凋亡率为1.34%（图2C）。诱导细胞凋亡2.5 h后，细胞凋亡率达到23.69%（图2B）。而裂殖子入侵的细胞，细胞凋亡率仅为4.57%（图2D），后者细胞凋亡率大约是前者的19.29%。

图2　流式细胞术检测MDBK细胞在各种处理方式下的凋亡水平注：左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞和晚期凋亡细胞，为（FITC＋/PI＋）；而右下象限显示早期凋亡细胞，为（FITC＋/PI-）；左上象限显示机械损伤细胞

2.3Cyto C，Csapase8，Caspase9，Caspase3的检测结果诱导细胞凋亡后，细胞浆中的Cyto C浓度大于线粒体中的含量（图3aB），且差异显著（P＜0.05）。攻虫后诱导细胞凋亡细胞浆中Cyto C的释放量也大于线粒体中的含量（图3aD），且差异显著（P＜0.05）。但是细胞浆中Cyto C的释放量小于细胞浆中Cyto C的释放量（图3aD），且差异显著（P＜0.05）。诱导凋亡组Caspase8酶活力高于空白组（图3b），因此，凋亡诱导有效。而攻虫诱导凋亡组caspase8酶活力低于诱导凋亡组，且差异显著（P＜0.05）。诱导凋亡组Caspase9酶活力高于空白组（图3c），且差异显著（P＜0.05），因此，凋亡诱导有效。而攻虫诱导凋亡组caspase9酶活力低于诱导凋亡组，且差异显著（P＜0.05）。诱导凋亡组Caspase3酶活力高于空白组（图3d），且差异显著（P＜0.05），因此，凋亡诱导有效。但攻虫凋亡组Caspase3酶活力高于诱导凋亡组，且差异显著（P＜0.05）。

图3　不同条件下4种凋亡因子的变化注：A：空白组；B：诱导凋亡组；C：攻虫组；D：攻虫诱导凋亡组；不同字母代表差异显著（P＜0.05），相同字母代表差异不显著

3　结论

本试验表明，E.tenlla裂殖子可以入侵并抑制MDBK细胞的凋亡，裂殖子可能是通过抑制细胞线粒体凋亡通路中CytoC，caspase8，caspase9的激活达到抑制细胞启动自我凋亡程序的，而Caspase3是否受到其他蛋白的调控还需要进一步研究。

4　讨论

本试验通过流式细胞术检测不同处理条件下的细胞凋亡状况，分析数据可以发现诱导凋亡组，细胞凋亡率达到23.69%（图2B），而攻虫凋亡组，细胞凋亡率仅为4.57%（图2D）。除此之外，诱导凋亡组细胞早期凋亡率为19.50%，晚期凋亡率为4.19%。诱导凋亡组细胞早期凋亡率为3.53%，晚期凋亡率为1.04%。由此可以证明，裂殖子不但可以抑制细胞凋亡，还可以延缓细胞进入早期凋亡的时间，以此延长自身在细胞内的生存时间。

在脊椎动物细胞凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置，而其关键性因子是细胞色素C。另外，Caspase8被认为是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个Caspase。在Fasreceptor和TNFR-1介导的细胞凋亡过程中Caspase8被激活，形成一个P18和P10组成的二聚体，进一步激活下游的Caspase4，Caspase6，Caspase9和Caspase10[5-6]。如图3a，3b，3c所示，D组均比B组数值低，即裂殖子可以通过抑制Cyto C，Caspase8，Caspase9的激活抑制或延缓细胞凋亡。而图3d所示，D组Caspase3酶活力高于B组，这可能是因为Caspase3作为直接的凋亡诱导因子处于细胞凋亡调控的最后一环，受到最多的正负调控，如近年研究发现，热休克蛋白家族和核转录因子（NF-κB）家族都具有阻断宿主细胞凋亡的作用。

目前，弓形虫与宿主细胞凋亡关系的研究主要集中于JNK通路，曾有报道，堆型艾美耳球虫存在与痘病毒抑制细胞凋亡相关[7]的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其主要抑制Caspase的活性。NF-κB通路几乎不依赖Caspase通路，而JNK通路的激活却和Caspase有很大关系。另外，发现牛艾美耳球虫入侵细胞可使Fas的表达受c-FLIP的影响[8]，而这个通路与弓形虫抑制凋亡的通路相关。该通路的受体TNFR1也是NF-κB的重要受体，通过连接TRADD，TRAF2/5，RIP1，激活核因子通路。弓形虫属与艾美耳属在遗传学上十分相近[9]，因此，我们推测，凋亡过程可能有另外的蛋白参与，或者E.tenlla裂殖子抑制宿主细胞凋亡的通路可能不止一条。

参考文献：

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[3]徐军.弓形虫抑制宿主细胞凋亡及其调控机制的研究进展[J].热带病与寄生虫学，2007，5（4）：257-261.

[4]张妍.Eimeria tenella宿主细胞线粒体凋亡通路MPTP开放及其调控机制的研究[D].太谷：山西农业大学，2014.

[5]刘光伟，龚守良.细胞凋亡的线粒体调控机制与电离辐射[J].国外医学：放射医学核医学分册，2003，7（2）：90-93.

[6] Herr I，Debatin K.Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy[J].Blood，2001.98（9）：2603-2604.

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[8] Lang M，Kann M，Zahner H，et al.Inhibition of host cell apoptosis by Eimeria bovis sporozoites[J] . Vet Parasitol，2009，160（1-2）：25-33.

[9] Martin W，Shirley，Dora A，et al.A Genetic Linkage Map of the Apicomplexan Protozoan Parasite Eimeria tenella[J].Genome Res，2000，（10）：1587-1593.

Thepathway of invaded cells to inhibit apoptosis by Eimeriatenellamerozoites

SONG Li-cong1，WANG Li-xia2，LIU Xin-yue1，ZHAO Chen-lu1，ZHANG Jian-jun1，AN Jian1
（1.College of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China）

Abstract：In order to study the inhibitory pathways of E.tenlla merozoites-invaded host cells after induction of apoptosis，the purified merozoites and MDBK cells were co-cultured for 1.5 h.The apoptosis was induced by complete medium containing 6%ethanol for 2.5 h.Then the apoptosis of MDBK cells was analyzed by flow cytometry .We used kit and spectrophotometry to measure the activity of cytochrome C，Caspase8，and Caspase9.The results of flow cytometry indicated that apoptotic rate was 4.57%in the merozoites group and apoptotic rate was 23.69%in of the group without merozoites，and the difference was significant（P＜0.05）.Early apoptotic rate was 19.50%and late apoptotic rate was 4.19%in the group without merozoites，while early apoptotic rate was 3.53%and late apoptotic rate was 1.04%in the merozoites group.The difference was significiant（P＜0.05）.Merozoites can not only inhibit apoptosis，but also delay cells into early apoptosis.The results also showed that the cyto C，Caspase 8，and Caspase 9 were decreased，while Caspase 3 unchanged.These results suggest that E.tenella merozoites inhibits apoptosis in MDBK cells induced by mitochondrial pathway.

Key words：E.Tenella；Merozoites；MDBK cells；Apoptosis；Pathway

Corresponding author：AN Jian

通讯作者：安健，E-mail：anyh001@bac.edu.cn

作者简介：宋丽聪（1991-），女，硕士生，研究方向为兽医寄生虫与分子生物学，E-mail：13436347439@163.com

基金项目：北京农业职业学院技术研发与示范推广项目（XFYF-14-09）

收稿日期：2015-03-24

中图分类号：S852.72+3

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0014- 03