何成伟，钟　勇，段保屹，廖春林，唐慧英，廖海燕，梁中平（.广西凭祥出入境检验检疫局，广西凭祥5600；.广西凭祥市水产畜牧兽医局，广西凭祥5600；.广西凭祥市科技局，广西凭祥5600）



黄喉拟水龟致病菌-维氏气单胞菌的鉴定及药敏试验

何成伟1，钟勇1，段保屹1，廖春林1，唐慧英2，廖海燕3，梁中平1
（1.广西凭祥出入境检验检疫局，广西凭祥532600；2.广西凭祥市水产畜牧兽医局，广西凭祥532600；3.广西凭祥市科技局，广西凭祥532600）

摘要：对患病黄喉拟水龟（Mauremys mutica）进行细菌学检查和分离，对分离到1株革兰阴性细菌进行形态特征、理化特征、VITEK 2 ZOMPACT 30自动微生物鉴定系统鉴定、结合16S rDNA序列的分子鉴定，并构建系统发育树；进行人工感染试验及药物敏感性试验。结果分离到1株优势菌，根据此株分离菌的形态特征、理化特征、自动微生物鉴定系统鉴定、结合16S rDNA序列测定与系统发育树分析结果，判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌。此菌对供试健康黄喉拟水龟和小鼠有较强的致病作用，对供试20种抗菌药物中的头孢吡肟、阿米卡星、氧氟沙星、米诺环素高度敏感；对洛美沙星、恩诺沙星、氯霉素等3种中度敏感；对头孢噻吩、环丙沙星等13种表现耐药。表明所检出的维氏气单胞菌，是导致黄喉拟水龟以出血和腹水为主要病理特征的致病菌。

关键词：维氏气单胞菌；鉴定；药敏；黄喉拟水龟

黄喉拟水龟（Mauremys mutica）为龟科拟水龟属的爬行动物。由于黄喉拟水龟具有较高的经济价值，近年来人工集约化养殖蓬勃发展，随之而来的疾病也越来越严重，这给养殖者带来比较大的经济损失。2014年8月，广西凭祥市某养殖户8年龟发病，以急性腹泻为特征性症状，患病动物以出血和腹水为主要病理特征，发病率30%，死亡率20%，对病死龟进行病理剖检和病原分离，对分离到的菌株采用细菌表型特征、生化试验以及VITEK 2 ZOMPACT 30自动微生物鉴定系统对分离菌株进行了鉴定，并进行了药敏试验，证明黄喉拟水龟所患疾病是由维氏气单胞菌引起。

1　材料与方法

1.1材料患病龟来源于广西凭祥市某养殖户。健康黄喉拟水龟6只，购自另一养殖户，每只体重约20 g。健康小鼠18只，购自广西医科大学实验动物中心，每只体重20 g。

血液琼脂平板，购自郑州安图绿科生物工程有限公司；药敏试纸、细菌生化微量鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；VITEK 2 ZOMPACT 30自动微生物鉴定系统为法国梅里埃公司产品；营养肉汤、麦康凯琼脂培养基，购自北京陆桥技术有限责任公司。PCR扩增和测序试剂为生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1细菌分离培养与纯化洗净病龟的外壳，体表用75%乙醇消毒后，无菌操作采集黄喉拟水龟的肝、肾、心血于血平板和麦康凯培养基上，28℃培养18～24 h，选取形态均一的优势菌群，挑取单菌落反复划线纯化3次，纯化所得菌株4℃保存。

1.2.2细菌生物学鉴定

1.2.2.1形态观察将保存菌株划线接种于营养琼脂平板上，28℃培养，观察菌落形态，挑取单个菌落进行革兰染色，在光学显微镜下观察菌体形态。

1.2.2.2生化鉴定分离菌理化特性鉴定参照《水生微生物学实验法》和《一般细菌常用鉴定方法》、《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》鉴定到种。

1.2.2.3分离菌用VITEK 2 ZOMPACT 30自动微生物鉴定系统鉴定取纯化培养的单菌落接种营养琼脂平板培养18～24 h，然后收集细菌。制备菌悬液，用0.45%NaCl溶液，制成0.5～0.63麦氏单位，pH值5.5～7.2的菌悬液。选取革兰阴性杆菌鉴定卡。28℃培养24 h，仪器自动分析并给予鉴定结果。

1.2.2.4分子生物学鉴定取1 mL培养好的菌液，按照革兰阴性菌提取试剂盒提取总DNA。使用25 μL反应体系，使用DreamTaq Green PCR Master Mix （2×）（Thermo Scientific）试剂盒进行PCR扩增：DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，加水定容至25 μL。扩增条件：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸9O s，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后将阳性样品送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得序列采用Blastn程序进行同源性检索，采用ClustalX软件进行多序列全局比对，利用MEGA6.O软件，选用Neighbour—Joining方法，自举1000次构建系统发育树。

1.2.3动物感染试验取纯化的菌株接种于营养肉汤中，28℃培养18 h。取1 mL作倍比稀释用倾注平板法测定每毫升中的细菌数，其余于4℃下保存。次日用无菌生理盐水将上述菌液稀释成4.0×10 CFU/ mL的细菌悬液，用于动物感染试验。

将6只健康黄喉拟水龟饲养7 d，随机分为2组：试验组4只，对照组2只。试验组，后腿肌肉注射0.3 mL菌液。对照组，后腿肌肉注射无菌生理盐水0.5 mL。均置于水温28℃、pH值7.2环境下饲养，从死亡龟中分离致病菌，并鉴定。

小鼠随机分成3组，每组6只。第1组小鼠肌肉注射菌液0.1 mL/只，第2组小鼠肌肉注射菌液0.2 mL/只，第3组做对照组，注射无菌生理盐水0.5 mL，28℃隔离饲养观察，并及时记录小鼠的发病和死亡情况，对死亡小鼠进行细菌分离和鉴定。

1.2.4药物敏感性试验采用标准Kirby -Bauer纸片扩散法对分离菌株进行常用的头孢吡肟、环丙沙星等20种抗生素药物的敏感性检测，28℃培养24 h后，测定抑制圈直径大小。

2　结果

2.1分离菌培养结果从患病黄拟水龟中分离纯化培养得到形态均一的细菌。该菌在麦康凯培养基上生长良好，菌落表面光滑湿润、圆形、隆起、边缘整齐、乳白色。营养琼脂上有灰白色、半透明湿润菌落生长。在血平板上，可观察到圆形、中央稍隆起、灰白色、明显β溶血的菌落。革兰染色镜检，该菌为革兰阴性杆菌，菌体呈两端钝圆，多单个或成双。

2.2生化鉴定结果菌株具有动力性；不发酵木糖、肌醇、卫矛醇、鼠李糖等；利用葡萄糖、棉子糖等；赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、氧化酶阳性；精氨酸双水解酶；其他生化结果见表1，参照《常见细菌系统鉴定手册》和布坎南等编的《伯杰细菌鉴定手册》，分离菌株的主要生化特征与维氏气单胞菌特性基本一致，初步鉴定分离菌株为维氏气单胞菌（A.veronii）。

表1　菌株生化特征

2.3VITEK 2 ZOMPACT 30自动微生物鉴定系统鉴定结果经用VITEK 2 ZOMPACT 30自动微生物鉴定系统鉴定，分离菌为维氏气单胞菌（A.veronii）。

2.4分子生物学鉴定结果以菌株的DNA为模板，扩增引物：正向引物16Sf：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′，反向引物16Sr：5′-aaggaggtgatccagaa-3′，进行PCR扩增，电泳显示扩增出大小约1 500 bp的特异性条带，结果见图1。经由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，得到实为1450bp大小的PCR产物片段，将序列进行Blastn比对分析发现，16S rRNA分别与GenBank数据库中公布的维氏气单胞茵（A.veronii）不同菌株16S rRNA基因序列同源性高达99%。选取25个气单胞菌属细菌16S rRNA序列，以及5个弧菌属（Vibrio）细菌16S rRNA序列作为外群，运用ClustalX2.0，MEGA6.0构建系统进化树，结果见图2。分离菌株与A.veronii菌株HSCC（GenBank登录号：KJ749842.1）聚为一簇。

2.5动物感染试验结果经过人工回归感染试验发现，分离菌株对黄喉拟水龟具有高致病性，接种后，症状与自然发病症状基本一致，对照组未见任何异样。从死亡龟和小鼠体内分离到与接种完全相同的细菌。

2.6药物敏感性试验结果分离菌对头孢吡肟、阿米卡星、氧氟沙星、米诺环素敏感；对洛美沙星、恩诺沙星、氯霉素中度敏感；对头孢噻吩、环丙沙星、诺氟沙星、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、克林霉素、四环素、红霉素、青霉素、复方新诺明、杆菌肽、阿莫西林表现耐药。

图1　菌株l6S rRNA基因扩增结果：M：Marker；泳道1：菌株扩增产物；泳道2：阴性对照（以水为模板）

图2　分离菌株与气单胞菌属细菌16S rRNA所构建的系统发育树||内为Genbank序列登录号

3　讨论

本试验从发病黄喉拟水龟体内分离的菌株对健康黄喉拟水龟表现出较强的致病力，且回归感染发病症状与自然发病龟的症状相似，对照组不发病，证实分离菌株为该病的病原菌。根据生理生化鉴定结果，发现该菌与维氏气单胞菌的生化标准基本一致，应用VITEK 2 ZOMPACT 30自动微生物鉴定系统鉴定，系统鉴定此菌为维氏气单胞菌，进一步采用16 S rRNA基因进行鉴定，16S rRNA分别与GenBank数据库中公布的维氏气单胞茵（A.veronii）不同菌株16S rRNA基因序列同源性高达99%，且系统分析显示，分离菌株与维氏气单胞菌在进化树上聚为一簇，结合病原菌的形态学特征进一步鉴定该菌为维氏气单胞菌。

维氏气单胞菌广泛存在于水体、污泥、土壤中，可产生一系列的毒力因子，如气溶素、肠毒素和粘附因子等[5]，这些毒力因子在水产动物、人类甚至畜禽感染中起着举足轻重的作用，可引起斑点叉尾鮰、大鲵、锦鲤、鲶鱼、中华绒螯蟹等大量死亡[2-4]。此外，该菌能感染人类，引起急性腹泻、菌血症、脑膜炎和心内膜炎等病症，是一种致病性强的新型人-鱼共患致病菌[5]，并在食品安全上表现出重要意义。本研究从患病的黄喉拟水龟分离到一株维氏气单胞菌，经人工回归试验显示出较强的致病性，进一步揭示了该菌在水产养殖动物中的病原性意义。使用药物防治此病，既要考虑细菌对药物的敏感性，也要遵守水产用药规定。

参考文献：

[1]吴同垒，单晓枫，孟庆峰，等.维氏气单胞菌研究进展[J].中国兽药杂志，2011，45（7）：41-44.

[2]黄小丽，吴春艳，邓永强，等.斑点叉尾鮰维氏气单胞菌病的病理组织学观察[J].中国兽医科学，2010，40（7）：738-742.

[3]王旭，颜其贵，陈玥，等.中国大鲵维氏气单胞菌病的组织病理学观察[J].中国兽医科学，201l，41（7）：737-740.

[4]秦国民，张晓君，陈翠珍，等.锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究[J] .安徽农业科学，2008，36（19）：8115-8117.

[5] Wu C J，Wu J J，Yan J J，et al.Clinical significance and distribution of putative virulence markers of 116 consecutive clinical Aeromonas isolates in southern Taiwan[J].Journal of Infection，2007，54（2）：151-158.

作者简介：何成伟（1969-），男，高级兽医师，硕士，从事动物疫病检疫工作，E-mail：hcw321@sina.com

收稿日期：2014-12-17

中图分类号：S947.9

文献标志码：B

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0106- 03