高云航，徐佳萍，赵晗旭，邸海洋，王　巍，娄玉杰，马红霞（.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春08；.中国农业科学院特产研究所，吉林长春0；.长春动植物公园，吉林长春006）



基于宏基因组学的成年和老年袋鼠肠道菌群多样性和差异性研究

高云航1，徐佳萍2，赵晗旭1，邸海洋3，王巍1，娄玉杰1，马红霞1
（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118；2.中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112；3.长春动植物公园，吉林长春130062）

摘要：为了了解袋鼠粪便中菌群的多样性，分析成年和老年袋鼠粪便中菌群的差异性。应用高通量测序技术测定成年和老年袋鼠粪便细菌16S rDNA的V3-V4变异区序列，应用Prinseq和Mothur等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元（OTUs）数量，分析菌群物种丰度、分布和Alpha多样性。获得成年袋鼠粪便（AK）的OTU数为7 210，老年袋鼠粪便（OK）的OTU数为6 120。AK和OK的丰富度指数分别为4 377.028/7301.574和1 430.718/1858.623，香农指数分别为6.275和4.273。AK和OK肠道优势菌群均隶属厚壁菌门，分别占65%（AK）和78%（OK），除此之外，共有优势菌门还有变形菌门、拟杆菌门和螺旋菌门，但AK有四种独有菌门。获得了成年和老年袋鼠粪便中细菌的丰富度、菌群结构及差异性。

关键词：袋鼠；肠道菌群；宏基因组学

袋鼠是典型的草食动物，是研究哺乳动物较好的动物比较模型。袋鼠前肠具有独特的消化功能，可进行高效能量转换，被广泛认为是低甲烷排放动物[1]。由于影响袋鼠的疾病主要为口腔疾病和消化道疾病[2]，因此，开展不同年龄袋鼠粪便中细菌多样性的研究和菌群结构的分析可为深入研究单胃食草野生动物消化道菌群提供理论基础，进而为减缓动物老龄化以及动物消化道疾病的防控提供新思路。宏基因组学作为新兴的分子生物学技术，适用于开展微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性以及其相互关系等相关研究[3]。本研究采用高通量测序技术对成年和老年袋鼠粪便进行细菌宏基因组分析，探明不同年龄袋鼠肠道细菌的物种丰富度和差异性，为进一步探讨野生动物的消化机制积累数据。

1　试验材料

袋鼠粪便：长春市动植物公园连续10 d采集4只成年健康袋鼠和4只老年健康袋鼠的新鲜粪便，-80℃保存备用。

2　试验方法

2.1袋鼠粪便总DNA提取提取成年与老年袋鼠粪便总DNA。成年袋鼠组（AK）与老年袋鼠组（OK）采集的粪便中随机采取每组各8g样品，分别加入25 mL PBS，反复低速离心去除杂质直至上清澄清，再将上清高速离心得到沉淀，预处理后采用CTAB法提取总DNA。

2.216S rDNA的扩增利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒定量总DNA，PCR引物为已融合Miseq测序平台的V3-V4通用引物。PCR扩增反应体系见表1，对PCR产物进行琼脂糖电泳，采用生工琼脂糖回收试剂盒回收DNA。回收产物用Qubit2.0定量，根据测得的DNA浓度，将样品按照比例进行混合，混合后充分震荡均匀，用于后续样品建库与测序。

表1　PCR反应体系

2.3生物信息学分析数据预处理后，采用Flash软件融合双末端序列，而后通过各样品barcode使数据回归样品，并对各样本序列做QC。然后去除非靶区域序列及嵌合体，采用RDP classifier将序列进行物种分类，根据序列之间的相似性作为域值分成操作分类单元（OTU）。最后计算各种物种多样性指数，衡量样本物种多样性。

3　结果

3.1袋鼠肠道细菌宏基因组DNA提取结果分别提取成年袋鼠（AK）和老年袋鼠（OK）粪便细菌基因组DNA，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，成功提取出目的DNA。利用Nanodrop 2000分光光度计测得DNA浓度与纯度均符合宏基因组测序的基本要求（表2）。

表2　袋鼠肠道细菌宏基因组DNA质量检测结果

3.2细菌16S rDNA V3-V4区片段的PCR扩增结果以提取的袋鼠粪便微生物总DNA为模板进行细菌16S rDNA V3-V4区片段的PCR扩增，切胶回收后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，成功扩增出大小为230 bp左右的目的片段。

3.3袋鼠肠道菌群多样性分析结果两个样品获得最终用于分析的序列条数、OUT数目、香农指数、Ace指数、Chao1指数样品覆盖率见表3，前插彩版图1为香农指数和丰富度稀疏分析图。

表3　各样品相关参数

3.4袋鼠肠道菌群差异性分析对单个样品中的OUT在门和属水平进行归类和整理。在门水平，AK肠道细菌隶属于11个门，厚壁菌门（Firmicutes）占比例最大（占65%），与OK组相比，特有的菌门为互养菌门（Synergistetes）、软壁菌门（Tenericectes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和广古菌门（Euryarchaeota）。OK肠道细菌隶属于7个门，厚壁菌门所占比例仍为最大（78%），其余的3个门仅占1%，前插彩版图2。

在属水平，AK肠道细菌隶属于92个属，丰度≥2%的属为瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）、RC9、普雷沃氏菌属（Prevotellaceae）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、毛螺旋菌属（Lachnospiraceae）、拟杆菌属（Bacteroides）、dgA- 11、hoa5-07d05、丁酸弧菌属（Butyrivibrio），其余84个属占19%。OK肠道细菌隶属于80个属，丰度≥2%的属为瘤胃球菌属、链球菌属（Streptococcus）、Barnesiella、普氏菌属（Prevotella）、密螺旋体属（Treponema），其余75个属占20%，前插彩版图3。

4　讨论

本研究采用高通量测序获得的袋鼠粪便中细菌丰度最高的为厚壁菌门，其次是拟杆菌门，因此这些微生物可能在纤维物质消化中起主要作用。李志鹏等[4]利用16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃细菌多样性，结果为梅花鹿瘤胃中87.9% 的16S rRNA基因序列与普雷沃氏菌属相似，Nelson等[5]研究报道了奶牛瘤胃及羚羊、斑马肠道内主要菌群，反刍动物瘤胃内最主要菌群为拟杆菌门的普雷沃氏菌，而非反刍动物肠道主要菌群为厚壁菌门的瘤胃球菌和梭菌。袋鼠为单胃草食动物，本研究中袋鼠粪便中微生物瘤胃球菌属与梭菌属为主，二者是产乙酸菌，利用氢气产生乙酸而不是甲烷，这有可能是单胃草食动物排放甲烷量低于反刍动物的原因。

本试验主要对比分析成年袋鼠与老年袋鼠粪便中菌群的差异，结果表明，年龄对袋鼠肠道菌群多样性及优势菌群的结构有一定影响。这与一些报道结果相一致[6-7]。在门水平，软壁菌门和疣微菌门是成年袋鼠粪便中所特有的，疣微菌门是一门被划出不久的菌门，主要存在土壤和人类粪便中，该类细菌有很大的研究空间。在属水平，除瘤胃球菌属为二者最主要优势菌群外，成年袋鼠粪便菌群中优势菌群为普雷沃氏菌属和毛螺旋菌属，而老年袋鼠组优势菌属为丁酸弧菌属、密螺旋体属和链球菌属，普雷沃氏菌是纤维降解菌，能产生一系列的木聚糖酶；丁酸弧菌是一类高效木聚糖降解菌；密螺旋体属和链球菌属可能是袋鼠老龄化产物，甚至有可能影响袋鼠的健康状态，这为进一步研究动物消化道调节机制提供依据。

由于高通量测序技术成本高以及野生动物样本采集存在一定困难，至今基于该技术对野生动物肠道菌群多样性的相关研究不多[8]，随着科研的不断深入，愈来愈多的野生动物不同生理时期的肠道菌群将得以揭示，为进一步探讨肠道菌群的作用机制提供参考数据。

参考文献：

[1] Mark Morrison . Looking large，to make more，out of gut metagenomics[J].Current Opinion in Microbiology，2013，16：630-635.

[2] Annemarie B，Harold T . The itinerary of Streptococcus gallolyticus infection in patients with colonic malignant disease[J] . The Lancet Infectious disease，2013，13（8）：719-724.

[3] Rondon M R，August P R，Bettermann A D，et al . Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms[J] .Appl Environ Microbiol，2000，66（6）：2541-2547.

[4]李志鹏，刘晗璐，崔学哲，等.基于16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃细菌多样性[J].动物营养学报，2013，25（9）：2044-2050.

[5] Nelson K E，Zinder S H，Hance I，et al.Phylogenetic analysis of the microbial populations in the wild herbivoregastrointestinal tract：instights into an unexplored niche[J] . Environmental Microbiology，2003，5（11）：1212-1220.

[6] Benson A K，Kelly S A，Legge R，et al.Individuality in gut micobiota composition is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors[J] . PNAS，2010，107：18933-18938.

[7] Wu S T，Baldwin R L，Li W Z，et al . The Bacterial Community Composition of the Bovine Rumen Detected Using Pyrosequencing of 16S rRNA Genes[J].PNAS，2012，1：1-11.

[8] Brulc J M，Antonopoulos D A，Miller M E B，et al.Gene-centric metagenomics of the fiber adherent bovine rumen microbiome reveals forage specific glycoside hydrolases[J] . PNAS，2009，106：1948-1953.

第25届世界家禽大会（WPC2016）暨中国畜牧兽医学会2016年学术年会征文通知

第25届世界家禽大会（WPC2016）暨中国畜牧兽医学会2016年学术年会将于2016年9月5日－9日在北京国家会议中心召开，届时中国畜牧兽医学会禽病学分会第十八次学术研讨会同期举行。本次大会由中国畜牧兽医学会主办，中国畜牧兽医学会家禽学分会、禽病学分会和北京博亚和讯农牧技术有限公司协办。

大会征文即日开始，诚邀畜牧兽医相关学科领域的科技工作者积极投稿，本届年会将继续评选优秀论文，颁发我国畜牧兽医学术界的最高荣誉-“中国畜牧兽医学会奖”及相关分会的优秀论文奖。大会诚挚邀请国内外家禽行业从业者参加本次大会，就行业内的热点问题与最新的科技和产业进展展开充分的交流、讨论，寻找更多的合作机会，共同促进家禽行业可持续发展。

1会议地点国家会议中心（北京市朝阳区天辰东路7号）

2会议征文的具体要求

本次会议分中英文征文，英文论文摘要将进入世界家禽大会论文集，中文论文摘要将进入中国畜牧兽医学会2016年学术年会论文集。两个会议征文具体要求：

大会将围绕“家禽产品的质量与安全：满足人类需要”主题，研讨和交流新理论和新技术。请进入会议网站http:// www.wpc2016.cn/zh/，点击摘要选择WPC摘要（投英文摘要入口）、年会摘要（投中文摘要入口）进入会议投稿系统。具体步骤请参看网站上的使用说明。；英文摘要截止日期为2016年2月5日，中文论文截止日期为2016年6月30日。

2016年年会将继续在投稿的在读研究生中挑选100名免费参加会议（免住宿、注册费），具体申请条件请见会议网站。免费参会学生申请材料邮寄地址：北京市朝阳区农展馆南路9号博雅园1-106（100125）。联系人：申凌、石娟，电话：010-85959006 85959010。E-mail：caav2007@163.com

3会议中文网站http://www.wpc2016.cn/zh/

4联系方式1. WPC2016征文（英文）咨询：连玲010-62731256 llian@cau.edu.cn，郑江霞010-62732741 info@wpc2016.cn。2.学术年会征文（中文）、免费参会学生、中宾参会咨询：（1）年会征文咨询：石娟010-85959010 caav001@163.com，（2）免费参会研究生咨询：申凌010-85959006 caav2007@163.com，（3）中宾参会咨询：刘海霞010-85959010 caav123@126.com。3.赞助、媒体参会咨询：王必勇010-82893959 meeting@boyar.cn。4.会员入会咨询：（1）家禽学分会：窦新红0514-85599035 jqxfhmsc@163.com。（2）禽病学分会：姚炜光010-51503677 qbxfhywg@126.com。5.团体会员单位参会咨询：颜海燕010-62125896，张高霞010-62125686，郭自干010-62110970，张保密010-62126106。6.住宿咨询及外宾参会咨询：代旭010-58166463 daixu@cytsmice.com

Study on intestinal flora in theadult and elderly kangaroos by themetagenomics

GAO Yun-hang1，XU Jia-ping2，ZHAO Han-xu1，DI Hai-yang3，WANG Wei1，LOU Yu-jie1，MA Hong-xia1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，China；2.Institute of special animal and plant sciences of caas，Changchun 130112，China；3.Changchun Zoological Botanical Park，Changchun 130062，China）

Abstract：To study the diversity of bacterial flora in kangaroo feces and analyze the differences between bacterial floras in adult kangaroo feces and in elderly kangaroo，we used high-throughput sequencing to measure the V3-V4 sequences of 16S rDNA in adult and aged kangaroo feces，use Prinseq and Mothur to settle and count the amounts of sample sequences and OTUs，and analyze the abundance of bacterial species，locations and Alpha diversity . Our study got 7 210 OTUs of adult kangaroo feces，and for elderly kangaroo feces，the numbers of OTUs were 6120.The abundance indexes of adult and elderly kangaroos were 4377.028/7301.574 and 1430.718/1858.623，and the shannon indexs were 6.275 and 4.273 for adult and aged kangaroos，respectively.The dominant bacterial flora of both kangaroos belongs to Firmicutes，and they occupied 65%（AK）and 78%（OK）respectively.In addition，common dominant Eumycotas were Proteobacteria，Bacteroidetes and Spirochaetae . However，there were four unique Eumycotas in adult kangaroo feces . In conclusion，we got the abundances，bacterial structures and differences from adult and elderly kangaroos.

Key words：kangaroo；intestinal flora；metagenomics

Corresponding author：MA Hong-xia

通讯作者：马红霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

作者简介：高云航（1975-），男，副教授，博士，研究方向为动物微生态学，E-mail：gaoyunhang@163.com

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-38）；国家自然科学基金项目（31372331）；吉林省教育厅科学技术研究项目（201358）；吉林省青年科研基金项目（20130522092JH）

收稿日期：2014-05-25

中图分类号：Q969.33+1.2

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0103- 02