林　雅，简燕娟，方志超，范才良，程方俊（.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌40460；.重庆市大足区宝兴镇人民政府，重庆大足407；.重庆市荣昌县畜牧兽医局，重庆荣昌40460）



48株大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶基因型检测

林雅1，简燕娟2，方志超1，范才良3，程方俊1
（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460；2.重庆市大足区宝兴镇人民政府，重庆大足402373；3.重庆市荣昌县畜牧兽医局，重庆荣昌402460）

摘要：为了解重庆地区部分鸭场大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因分布情况及抗生素的应用对鸭场环境菌的影响。本试验采用PCR技术，对48株大肠杆菌（包括20株病料分离株和28株鸭场土壤分离株）的ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M进行检测。结果表明，TEM、SHV、CTX-M型基因在病料分离株中的检出率分别为100%、30%、25%，鸭场土壤中的检出率分别为57.1%、21.4%、28.6%。不同来源的菌株均能检测出耐药基因，且部分细菌携带两种以上耐药基因；病料分离株和鸭场土壤分离株中携带的ESBLs基因均以TEM型为主。

关键词：鸭源大肠杆菌；超广谱β-内酰胺酶；耐药基因

鸭大肠杆菌病是兽医上常见的重要细菌病之一。随着抗菌药物的广泛应用，大肠杆菌的耐药性日趋严重，给兽医的临床治疗带来了极大困难。产β-内酰胺酶是大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因，其中，超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）具有重要的临床意义[1]。ESBLs是能同时耐青霉素、1-3代头孢菌素及氨曲南的酶，该编码基因家族有SHV、TEM、CTX-M等[2]。近年来，耐β-内酰胺类抗生素的动物源大肠杆菌不断被发现并引起全世界的关注。在国外，Aarestrup F. M.，N.Silva[3-4]等先后对携带产ESBLs的相关基因的大肠杆菌做了研究报道；在国内，刘保光，田国宝等也先后作了相关报道[5-6]。

目前，耐药基因型检测是国内外研究细菌对超光谱β-内酰胺环类耐药机制的重要领域之一。本试验从重庆市渝西地区部分鸭场发病鸭采取病料及鸭场土壤采样分离细菌，对分离菌株超光谱β-内酰胺酶基因进行了检测及分析。本试验有助于了解重庆地区养鸭场内大肠杆菌中ESBLs基因分布特点及抗生素的应用对鸭场环境菌的影响，为重庆市鸭大肠杆菌病的防控及用药提供参考依据。

1　材料与方法

1.1试验菌株于2013年3-9月在重庆地区多个养鸭场采集并分离纯化、鉴定的大肠杆菌48株，包括从病料中分离致病菌20株，鸭场土壤中分离环境菌28株。

1.2试剂常规质粒提取试剂盒E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I（购自广州飞扬生物工程有限公司），PCR反应试剂盒、Gold-view核酸染色剂、DL-2 000 Marker、6×Loading Buffer（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）。

1.3PCR检测ESBLs基因引物SHV、TEM、CTXM基因引物设计参照参考文献[7]，TEM基因:上游：5′-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3′，下游：5′-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3′；SHV基因:上游：5′- GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG-3′，下游：5′- TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA-3′；CTX-M基因：上游：5′- GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG-3′，下游：5′- CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC -3′。分别合成相应PCR引物。模版DNA制备：按照试剂盒E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I操作步骤提取质粒DNA。PCR反应：PCR扩增采用25 μL体系。TEM基因反应参数为：95℃5 min；95℃40 s，47℃40 s，72℃l min，循环30次；72℃10 min；SHV基因反应参数为：95℃5 min；95℃1 min，52℃1 min，72℃1 min，循环30次；72℃10 min；CTX-M基因反应参数为：95℃5 min；95℃45 s，55℃45 s，72℃45 s，循环30次；72℃10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶DNA成像仪分析结果。

2　结果

2.1ESBLs基因PCR扩增结果

2.1.1ESBLs基因PCR扩增凝胶电泳结果ESBLs三种耐药基因TEM、SHV、CTX-M的PCR扩增凝胶电泳结果，如图1、图2、图3所示。图示为部分耐药基因PCR扩增产物电泳图，大小与目的片段基因相符。1-20号为致病菌株，21-48号为环境菌株。

图1　TEM基因凝胶电泳图1、10、20：分别代表编号为1、10、20的致病菌株；29、34、44：分别代表编号为29、34、44的环境菌株；M：DL-2 000 DNA Marker

图2　SHV基因凝胶电泳图5、13、19：分别代表编号为5、13、19的致病菌株；26、34、44：分别代表编号为26、34、44的环境菌株；M：DL-2 000 DNA Marker

图3　CTX- M基因凝胶电泳图6：编号为6的致病菌株；22：编号为22的环境菌株；M：DL-2 000 DNA Marker

2.1.2ESBLs基因检测结果分别统计致病菌株E. coli-1到E.coli-20和环境菌株E.coli-21到E.coli-48 ESBLs基因阳性数，结果见表1。从表中可知，48株大肠杆菌中TEM基因的检出率为75%，SHV基因检出率为25%。CTX-M基因检测率为27.1%。TEM＋SHV复合基因检出率22.9%；TEM＋CTX-M复合基因检出率18.8%；SHV＋CTX-M复合基因检出率8.3%；TEM＋SHV＋TEX-M复合基因检出率4.2%。

表1　产ESBLs大肠杆菌菌株的耐药基因检测结果

3　讨论

β-内酰胺酶的出现对细菌性疾病的治疗带来了极大的威胁，特别是革兰阴性杆菌中流行的ESBLs，成为兽医临床急待解决的难题。由于编码β-内酰胺酶的基因多数为质粒介导，使得耐药基因可以在菌株之间通过结合和转化等方式传播，导致耐药基因扩散蔓延[8]。对大肠杆菌中ESBLs基因的检测，可了解ESBLs基因分布特点，为鸭场大肠杆菌病的防控及用药提供参考依据。

在耐药基因分布上，本试验中产ESBLs的基因型检测发现，从48株大肠杆菌耐药基因检测结果中TEM型、SHV型、CTX-M型均可见。TEM型阳性菌株较多见，这与许颖等[9]检出的产ESBLs大肠杆菌主要基因型为TEM型相似，与李林等[10]关于CTX-M型检出率高的结果稍有差异，另外，本试验结果中SHV型检出率占有一定比例，而苑丽[11]等对分离出30株鸡源大肠杆菌产ESBLs的基因型检测发现，SHV阳性率为0，可能是由于不同地区，不同宿主，不同的用药情况等因素，导致耐药基因型的分布率有所不同。有资料显示，中国产ESBLs的大肠杆菌基因型以CTX-M型为主，美国以TEM型和SHV型为主，欧洲从以TEM、SHV型转变为以CTX-M型为主，也有资料称近几年来，世界各地频繁地发现CTX-M型[12-13]，这些资料也进一步揭示不同地区流行的基因型的确有所差异。

从检测结果中还发现不同来源的菌株均能检测出耐药基因，且部分细菌携带两种以上基因。说明质粒介导及其他形式的耐药基因传递，增加了SHV＋TEM、TEM＋CTX-M甚至TEM＋SHV＋TEX-M等基因型的出现，更增加了大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素耐药的复杂性与临床用药难度，应引起临床重视。

在研究结果中，病料分离株ESBLs耐药基因的检出率从高到低依次为TEM（100%）、SHV （30%）、CTX-M（25%）；鸭场环境分离株耐药基因的检出率从高到低依次为TEM（57.1%）、CTX-M （28.6%）、SHV（21.4%）。病料分离株与鸭场环境分离株耐药基因的检出率存在一定相关性，两者携带ESBLs基因均以TEM型为主。但同一基因两者的检出率并不相同或相近，说明存在于病料分离株的大肠杆菌和环境分离株中的有一定差异。可能是由于兽医临床上用药不规范，且常常使用亚治疗剂量的β-内酰胺类抗生素作为饲料添加剂预防感染性疾病，从而导致鸭场环境中的大肠杆菌在药物选择的作用下，出现耐药基因菌株。滥用抗生素，已对养殖场环境造成不良影响。环境中的耐药菌可通过质粒介导等方式，将耐药基因传递给鸭体内的大肠杆菌群，或者鸭群直接从环境中感染，再将易感染的大肠杆菌排泄入环境中，如此恶性循环，给养殖业造成巨大的损失。

参考文献：

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[2] Kenneth S . Thomson . Extended-spectrum-β-lactamase，AmpC，and carbapenemase Issues[J] . J Clin Microbiol，2010，48（4）：1019-1025.

[3] Aarestrup F M，Hasman H，Agerso Y，et al . First description of blaCTX-M-1-carrying Escherichia coli isolates in Danish primary food production [J] . J Antimicrob Chemother，2006，57（6）：1258-1259.

[4] N Silva，L Costa，A.Goncalves，et al.Genetic characterisation of extended- spectrum β- lactamases in Escherichia coli isolated from retail chicken products including CTX-M-9 containing isolates: a food safety risk factor [J] .British Poultry Science，2012，53（6）：747-755.

[5]刘保光，肖尚修，吴华，等.鸭大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶的检测及药物敏感性分析[J].中国畜牧兽医，2010，37（9）：188-191.

[6]田国宝，王红宁，张安云，等.规模化猪场大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性检测及其超广谱β-内酰胺酶调查[J].中国预防兽医学报，2011，33（10）：776-780.

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[9]许颖，李晓庆，江俊，等.产ESBLs大肠埃希菌耐药基因分型研究[J].四川医学，2009，30（9）：1363-1366.

[10]李林，赖小美，郭有能，等.大肠埃希菌的耐药特点与产超广谱β-内酰胺酶基因型分布[J].中华医院感染学杂志，2012，22（15）：3206-3208.

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[13] Rafael Canton，Teresa M . Coque . The CTX-M beta-lactamase pandemic[J].Curr Opin Microbiol，2006，9（5）：466-475.

Detection of extended- spectrum β- lactamases genotypeamong 48 Escherichiacoli

LIN Ya1，JIAN Yan-juan3，FANG Zhi-chao1，FAN Cai-liang3，CHENG Fang-jun1
（1.Department of Veterinary Medicine，Rongchang Campus of Southwest University，Chongqing 402460，China；2.The People's Government of Baoxing town，Dazu district in Chongqing，Chongqing 402373，China；3.Animal Husbandry Bureau of Rongchang，Chongqing 402460，China）

Abstract：The purpose of this study was to detect genotype of ESBLs in E.coli isolated from duck and farm in Chongqing，and the influence of antibiotics on the environmental E.coli in farm.PCR amplifications was applied to detect the β-lactam resistant genotypes TEM，SHV，and CTX-M of extended-spectrum β-lactamases（ESBIs）from 48 isolates，20 isolated from duck and 28 isolated from farm.The results showed that the detection rates of drug resistant genotypes of TEM，SHV，and CTX-M from epidemic materials were 100%，30%，and 25%respectively，and those from soil were 57.1%，21.4%，and 28.6%，respectively.In conclusion，drug resistant genotypes or composite genotypes can be detected from strains of different sources，and the major ESBLs genotype was TEM.

Key words：Escherichia coli；ESBLs；Resistant gene

Corresponding author：CHENG Fang-jun

通讯作者：程方俊，E-mail：cfj-xn@163.com

作者简介：林雅（1989-），女，硕士，研究方向为动物微生物学及免疫学，E-mail：lyaodly@163.com

基金项目：西南大学博士启动基金2013BSr03

收稿日期：2014-05-28

中图分类号：S852.61

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0100- 03