张　辉，杨　欢，高云航，杨　倩，杨　亮，尹　剑，常晓博，崔焕忠（吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118）



猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟混合感染的诊断

张辉，杨欢，高云航，杨倩，杨亮，尹剑，常晓博，崔焕忠
（吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的以母猪发热、厌食、流产、产死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的一种疾病，且易引起免疫抑制，造成混合感染。该病于1987年在美国的北卡罗那、伊阿华、明尼苏达等州的猪群首次暴发，1996年我国首次分离出PRRSV，PRRS给全世界的养猪业带来了极大的经济损失。猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的严重危害全球养猪业的一种高度接触性传染病，发病率和死亡率高，造成的损失大。我国很多猪场都存在这2种传染病，而且PRRSV和CSFV常呈混合感染给养猪业造成了巨大的经济损失。

1　发病情况

2013年11月吉林公主岭某养猪场仔猪与育成猪陆续发病，病猪精神不振，食欲不佳，便秘或腹泻，粪便淡黄，呼吸困难，皮肤发绀，后期出现神经症状，病程4～7 d，病情逐步恶化，并相继死亡。部分母猪出现采食量下降，分娩母猪产死胎数上升。送检5只死亡仔猪，其中哺乳仔猪2只，断奶仔猪1只，木乃伊死胎2只。

2　临床症状

病猪体温升高至39.6℃～41.3℃之间，精神沉郁，采食减少或不食，病猪皮肤发绀，仔猪有不同程度的呼吸困难，呈腹式呼吸，颈下、腹部和后肢侧皮肤出现淤血和水肿，部分病例皮下有出血斑，个别仔猪出现神经症状。怀孕母猪出现流产、木乃伊胎和死胎。

3　病理剖检

对送检死亡猪只剖检，病死猪耳朵发绀，猪鼻发紫，全身、四肢出现大小不等紫黑色圆形的斑点，肺脏肿大，肺间隔增宽，呈间质性肺炎（见前插彩版图1），胸腔有大量黄色积液。全身淋巴结肿大（见前插彩版图2），特别是肺门淋巴结。肝脏肿大，表面有灰白色坏死灶（见前插彩版图3）。脾脏稍肿大、质地稍硬、边缘梗死（见前插彩版图4）。肾肿大、表面有针尖大出血点，心外膜出血，心包积液，肠系膜淋巴结中大出血，肠黏膜脱落，溃疡。回盲瓣有纽扣状溃疡。膀胱有溃疡、出血。木乃伊胎脐带出血明显，肾大量出血，肝呈黄红色，心包积液，肺肉样变，淋巴结肿大。

4　实验室诊断

4.1细菌检测无菌采集病猪的心血、淋巴结、脾脏、肝脏和肺脏等组织，进行涂片镜检，未见致病菌；同时进行细菌常规培养，37℃培养48 h观察，亦未见可疑菌落。

4.2RT-PCR检测

4.2.1RNA提取无菌采集病猪的血液、肺脏、肝脏、淋巴结和脾脏等组织，加入无菌生理盐水，冰浴中匀浆5 min（无组织残留），将匀浆液转移至无核酸酶离心管中，-75℃反复冻融3次。按照RNA Lyzol试剂盒，购自上海依科赛生物制品有限公司，操作说明提取总RNA。

4.2.2引物设计合成PRRSV引物根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒ATCC VR-2332株（GenBank：U87392.3）的ORF7基因序列，设计一对特异性引物，上游引物：5′- AAC GGC AAG CAG CAG AAG-3′，下游引物：5′-TGC GTA GGC AAA CTA AAC TC-3′。CSFV引物引用罗廷荣等设计引物[2]，上游引物：5′-GCTCCTGGTTGGTAAC-CTCGG-3′，下游引物5′-TGATGCT GTCACACAGGTGAA-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，PRRSV预计扩增片段大小为629 bp，CSFV预计扩增产物为508 bp。

4.2.3cDNA合成利用M-MLV第一链合成系统，购自Invitrogen公司，合成cDNA，反应体积为20 μL。将灭菌蒸馏水9 μL、总RNA 2 μL、10 mmol/ L dNTP混合物1 μL和Oligo（dT）201 μL加入到无核酸酶的微量离心管中，混合物在65℃加热5 min后，迅速置于冰上冷却。短暂离心后再加入5×第一链合成缓冲液4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL，轻轻混合后，在37℃下孵育2 min。加入M-MLV逆转录酶1 μL（200 U），混匀后，37℃孵育50 min。最后70℃加热15 min终止反应，利用反应产物进行PCR。4.2.4 PCR反应利用2x Taq Master Mix（购自北京康为世纪生物科技有限公司）进行PCR反应，反应体积为20 μL，反应组成为：2×Taq Master Mix 10 μL、RNase-Free Water 8.0μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、cDNA 1.0 μL。同时设阳性对照和阴性对照，阳性对照以PRRSV和CSFV标准株的cDNA为模板，阴性对照以灭菌蒸馏水为模板。PRRSV PCR反应循环参数为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸35 s，35个循环，最后72℃延伸8 min；CSFV PCR反应循环参数为94℃预变性2 min，94℃变性50 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。4.2.5 PCR结果分别取两个PCR产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，采取病猪的血液、肝脏、肺脏、淋巴结和脾脏样品，进行RT-PCR均扩增出629 bp（PRRSV）、508 bp（CSFV）大小的特异性条带，与阳性对照相符，阴性对照则没有出现目的条带（图5、图6），表明所检测病料PRRSV和CSFV阳性，结合临床症状和病理剖检变化等，可诊断为PRRS与CSF混合感染。

图5　病料组织PRRSV RT- PCR检测电泳M：DL-2 000 DNA Marker；1：阳性对照；2：血液样品；3：肺脏组织；4：肝脏组织；5：淋巴结；6：脾脏；7：阴性对照

图6　病料组织CSFV RT- PCR检测电泳M：DL-2 000 DNA Marker；1：阳性对照；2：血液样品；3：淋巴结；4：脾脏；5：阴性对照

5　讨论

PRRS是一种免疫缺陷病，破坏感染猪免疫系统，导致猪免疫力下降，进而造成混合感染，特别是PRRS和SCSF经常混合感染，在临床上二者感染后引起的临床表现相似，给临床诊断造成很大困难。因此早期诊断并及时了解发病状况，对控制PRRS和SCSF的流行显得尤其重要。

PRRSV的ORF7基因都具有高度的遗传稳定性，保守性极高[2]，以ORF7基因为检测目标的RT-PCR方法已广泛用于PRRSV的实验室检验，该方法可用于血清、组织和肺泡巨噬细胞等样品的检验，检测速度快，具有高度的敏感性和特异性，可以检测到组织培养物中30个PRRSV单位，敏感性也要比病毒分离方法高10倍左右，且可以避免病毒的播散[3]。

目前针对PRRSV和CSFV的血清学检测方法还包括血清病毒中和法（SVN）、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接荧光抗体试验（IFN）和间接ELISA[4-5]，但这些方法不能判断出抗体的产生是由病毒感染还是注射灭活疫苗引起的[6]，且检测时间较长。本研究建立了快速检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法，具有敏感性强的特点，大大缩短了检测时间，为临床治疗赢得了时间。

由于试验条件与时间关系，本试验监测结果未做对比试验。

参考文献：

[1]罗廷荣，莫扬，吴文德，等.RT－PCR技术诊断猪瘟的应用研究[J].中国预防兽医学报，2003，25（3）：219 -222.

[2]鲁韦韦，姜平，唐泰山，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的遗传变异分析[J].物医学进展，2007，28（11）：26-30.

[3]郎广平，郭敏，韩盈盈，等.猪繁殖与呼吸综合征诊断方法与疫苗研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40（6）：195-197.

[4]洪猛，周碧君，王开功，等.猪繁殖与呼吸综合征疑似病例实验室诊断[J].动物医学进展，2013，34（10）：122-127.

[5]朱佳毅，任晓峰.猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的研究进展[J].中国预防兽医学报，2014，36（1）：77-79.

[6] Janková J，Celer V.Expression and serological reactivity of Nsp7 protein of PRRS genotypeⅠvirus[J] . Research in Veterinary Science，93（2012）：1537-1542.

通讯作者：崔焕忠，E-mail：huanzhongcui@163.com

作者简介：张辉（1973-），女，高级实验师，博士，研究方向为临床兽医学，E-mail：huizhang01525@163.com

基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（吉教科合字[2015]第26号）；吉林省科技厅自然科学基金项目（20150101107JC）；吉林省科技厅基础研究项目（20140101028JC）；吉林省现代农业产业技术体系建设专项

收稿日期：2014-08-05

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：B

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0068- 02