张西云，范玉霞，李生庆，胡国元，李志宁，李秀萍，王亭亭，黄　荣，刘怀新（青海省畜牧兽医科学院，青海西宁810016）



绵羊肠毒血症的诊断与防治

张西云，范玉霞，李生庆，胡国元，李志宁，李秀萍，王亭亭，黄荣，刘怀新
（青海省畜牧兽医科学院，青海西宁810016）

青海省祁连县默勒镇外日沟乡从2006年7月转入夏季草场开始发生绵羊死亡，死亡的绵羊多为当年的羔羊和2岁以内的羊，从夏季草场转入秋季草场放牧时（9月份）绵羊死亡数进入高峰期。从2007年开始，该镇另外两个村多隆、老日当村也相继发生绵羊大量死亡，至今累计死亡3 358只，据当地牧民介绍每天每家至少死亡5～7只，有的牧户家已死亡80余只，给他们带来了巨大的经济损失。发病羊群均已进行了药物驱虫工作，并正常接种过羊四联疫苗（猝疽、羔羊痢疾、快疫、肠毒血症）。

2008年8月，我们在发病地区采集了4份病死羊脏器及肠内容物，进行了病原诊断和菌苗研制，报告如下。

1　病原诊断

1.1临床症状病程约1～3 d，多数病羊晚上入圈时看不出症状，早晨放牧时发现死于圈中，主要症状为食欲废绝，跌倒后四肢划动呈游泳状，头向一侧仰，抽搐，很快死亡。

1.2剖检变化死亡羊只除肾脏软化外，心、肝、脾、肺等脏器均未见到明显病理变化。少数羊只心包液增量呈淡黄色，心脏扩张，心肌松软，肺脏充血、水肿，肾脏实质柔软松驰，肝脏肿胀、质脆，淋巴结切面湿润，小肠黏膜充血，死羊腹部膨胀。

1.3细菌分离和鉴定

1.3.1细菌分离取肠内容物，分别接种于厌气肝汤和鲜血琼脂平板，37℃培养24 h，涂片见到产气荚膜梭菌，然后接种该培养物于鲜血琼脂平板上，挑取溶血菌落，得到纯培养物。

1.3.2细菌的特性：

1.3.2.1生长特性本菌在厌气肝汤中3～4 h即开始产气，24 h生长停止，并开始沉降，在鲜血琼脂平板上厌气培养，24 h开始生长，48 h可见圆形略隆起、灰白色半透明的菌落，菌落周围有溶血环。

1.3.2.2毒素测定分自4只羊的四株菌对小鼠的最小致死量分别为400、400、1 600 MLD/mL及400 MLD/mL。

1.3.2.3细菌的型别分离到的4株细菌的毒素都能被D型产气荚膜梭菌抗血清中和。

2　肠毒血症菌苗的研制

2.1制苗用培养基牛肉胃酶消化液培养基：牛肉胃酶消化液10 000 mL（常规方法制造），蛋白胨50 g，示胨50 g，Na2HPO4·12H2O 100 g，糊精100 g，pH值8.5，10磅40分。

2.2菌苗制造方法

2.2.1菌液制备培养基经高压后，凉至38℃左右时立即接种，种子量为1%，放37℃温室培养24 h。

2.2.2毒价测定逐瓶吸取2 mL菌液，与等量的含0.25%胰酶（效价1∶250）的1%碳酸钠液混合，置37℃作用40～60 min，4 000 r/min离心10 min、稀释、测毒。

2.2.3菌苗制造在纯检合格的菌液中加1%甲醛溶液，置于37℃杀菌、脱毒，21 d，过滤后加入无菌的20%氢氧化铝胶溶液，使菌苗中氢氧化铝含量达7 mg/mL，分装、检验、备用。

2.3菌苗效力：

2.3.1家兔效力检验0901、1001、1002及1101四批菌苗分别用体重1.5～2 kg的健康家兔，随机分成4组（1002批2组），免疫组皮下注苗0.1、0.5、1 mL，每组4只，对照组2只，均为皮下注射。饲养至21 d，静脉攻毒。

2.3.2绵羊效力检验0901、1002、1101及1201四批菌苗分别用体重30～40 kg的健康绵羊，随机分为11组，每批菌苗按0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL分别免疫3组（1201批2组），每组4只，均为肌肉注射，免疫18 d后连同对照2只静脉攻毒，观察记录死亡情况。

3　结果

3.1诊断根据流行病学、临床症状，剖检变化，细菌分离、毒素测定及中和试验诊断为D型产气荚膜梭菌引起的肠毒血症。

3.2菌株产毒情况经过4年试验，用牛肉消化培养基，其产毒素的能力最高可达4万MLD/mL，少数为5 000 MLD/mL（制苗时废弃），多数为2～1 万MLD/mL。

表1　2009- 2012年菌株产毒情况

表2　2009- 2012年各批菌苗毒价情况

3.3效检结果

3.3.1家兔效检结果3批菌苗以0.1 mL免疫，3批均3/4保护，攻毒量1～2个家兔MLD，效果良好。4批菌苗以0.5 mL免疫，3批4/4保护，1批3/4保护，攻毒量1～3个家兔MLD，效果良好。3批菌苗以1 mL免疫，2批3/4保护，1批2/4保护，攻毒量1～5个家兔MLD，效果良好。

3.3.2绵羊效检结果4批菌苗以0.5 mL免疫，2 批4/4保护，2批3/4保护，而且攻毒量均较大，多数攻6～8个绵羊MLD，效果良好。4批菌苗以1.0 mL免疫，3批4/4保护，1批3/4保护，攻毒量更大，多数攻8～10个绵羊MLD，效果更好。3批菌苗以2.0 mL免疫，全部4/4保护，攻毒量更大，多数攻12～15个绵羊MLD，效果很好。

4　菌苗使用情况

2009-2012年用新研制的羊肠毒血症菌苗在祁连县默勒乡共免疫羊30.5万只，其中2009年免疫6.5万只，2010年免疫5万只，2011年免疫6万只，2012年免疫5万只，2013年免疫8万只，免疫羊未发现肠毒血症病例，有效的控制了该病的发生和流行。

表3　肠毒血症菌苗家兔效力检验情况

表4　肠毒血症菌苗绵羊效力检验情况

5　讨论

5.1通过改进培养基和培养方法，使D型产气荚膜梭菌产毒素的能力最高达4万MLD/mL，高出规程的20倍。

5.2菌株产毒较高的原因虽然与培养基有关，但主要是培养基中加入了缓冲剂，国外有报道，D型产气荚膜梭菌在pH值较高时产毒较好，我们的试验证明了这点。

5.3根据农业部兽医生物制品规程规定，肠毒血症单价苗，以3 mL剂量免疫绵羊，攻致死量毒素，3/4保护即为合格。我们制成的4批菌苗，最小免疫量0.5 mL即可抗6～8个绵羊最小致死量的攻击，1 mL免疫量可抵抗10 MLD绵羊最小致死量的攻击，说明效果良好。

5.4本菌苗免疫性好的主要原因是提高了菌液的含毒量，制苗时以10 000 MLD/mL为最低标准（规程定为2 000 MLD/mL），所以最小免疫量0.5 mL，仍有较好的效果。

作者简介：张西云（1965-），女，研究员，本科，研究方向为传染病学，E-mail：zhangxiyun65@126.com

收稿日期：2014-05-23

中图分类号：S858.26

文献标志码：B

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0060- 02