吴　凌，孙雨航，许楚楚，李昌盛，夏　成（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）



国内流行犬瘟热病毒DNA重组疫苗的初步研究

吴凌，孙雨航，许楚楚，李昌盛，夏成
（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

摘要：为了探究H蛋白的免疫原性以及抗体效价，构建了1株犬瘟热病毒（CDV）ZH-10株H基因的真核表达载体pCI-H，对表达产物的免疫原性进行了初步研究，并进行了小鼠的DNA免疫试验。结果显示，pCI-H免疫组血清可与感染病毒的MDCK细胞发生特异性IPMA反应呈现特异的棕红色；ELISA血清抗体滴度可达1∶28～1∶79；病毒中和抗体可达1∶11～1∶32。研究结果表明，H蛋白具有免疫原性，但诱导抗体效价不足，需进一步完善。

关键词：犬瘟热；ZH-10株；H基因；真核表达；DNA重组疫苗

犬瘟热（canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，严重影响特种养殖业的发展。H蛋白作为CDV囊膜表面的主要糖蛋白，不仅在病毒融合、病毒组织嗜性等方面发挥着关键作用，还是刺激机体产生中和抗体的主要抗原，且发现H蛋白在所有结构蛋白中变异率最高[1]。

目前CD弱毒苗虽能有效地控制CD的流行，但由于H蛋白基因变异率大，抗原表位漂移而使毒力改变[2]，使制备的疫苗不能完全保护动物免受异源毒株的感染。Camila及Nathalie等报道提示，H蛋白可以用于CDV的预防控制，其抗体可用于CDV感染的诊断或流行病学调查[3]。因此，筛选出具有免疫原性良好的毒株，进而构建出以野毒株抗原基因为骨架的新型疫苗，具有重要的实际意义。

1　材料与方法

1.1细胞、病毒、血清、抗体、载体和实验动物

SV40转化的非洲绿猴肾细胞（MDCK细胞）、CDV病毒液、重组质粒pMD18-H，真核表达载体pCI neo质粒DNA等，由本室保存和提供；HRP标记的羊抗鼠IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；FITC标记的兔抗鼠IgG、羊抗兔IgG，购自Sigma公司；真核表达载体pCI和克隆载体pMD18-T，购自宝生物工程（大连）有限公司；5～6周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2主要试剂DMEM、Opti-MEM等，购自GIBCO公司；TRIZol LS Reagent、R Lipofectamin™2000等，购自Invitrogen公司；各种酶类以及DNA连接系统等，购自宝生物工程（大连）有限公司；SDSPAGE及Western Blot试剂，均购自Sigma公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.3真核表达载体pCI-H构建用双酶切已获得的重组质粒pMD18-H和真核表达载体pCI neo质粒DNA。将回收的H基因片段和pCI neo线性化质粒，经T4 DNA Ligase连接、转化感受态细胞，抗性筛选后提取质粒。拟获得的重组真核表达载体命名为pCI-H。

1.4pCI-H酶切及PCR鉴定经单酶切和双酶切鉴定pCI-H。以酶切正确的质粒为模板，利用HF/ HR引物针对H基因进行PCR鉴定。经1%琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆，送Invitrogen公司测序，验证其正确的ORF。

1.5pCI-H大量制备和纯化参照Wziard Pure-Fection Plasmid DNA Purification System试剂盒说明书进行提取。对获得的质粒DNA测定OD260/ OD280值。

1.6pCI-H转染MDCK细胞转染前8 h，消化MDCK细胞，待达到约50%左右细胞密度，弃去培养液，用DMEM清洗后，Opi-MEM作用2 h，按照Lipofectamin™2 000说明书进行转染。

1.7转录体mRNA的检测转染48 h后收集3组细胞，提取细胞总RNA，测定RNA的浓度，立即以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR操作，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否转录。

1.8间接免疫荧光（IIF）检测pCI-H的体外表达

将转染pCI-H的细胞以合适密度接种到培养板上，常规方法培养后利用IIF检测pCI-H在哺乳动物细胞中的表达情况。同时设置正常细胞对照。

1.9表达产物SDS-PAGE和Western Blot分析刮取转染后48 h的MDCK细胞同培养液一起离心取沉淀后加入20 μL PBS重悬细胞，加入等体积的2倍缓冲液，振荡均匀，裂解细胞，然后进行12%SDS-PAGE及Western Blot分析以验证H蛋白的表达情况。

1.10重组真核表达载体pCI-H的动物免疫原性试验取10只5～6周龄健康BALB/c小鼠，随机分为2组，观察3 d后，肌肉注射pCI-H和空载体pCI neo，免疫程序参照表1；免疫前剪尾采血，4免后7 d眼眶采血，均分离血清备用。

表1　动物免疫程序

1.11IPMA检测抗血清与病毒的结合能力为验证免疫血清能否与病毒表达在感染细胞表面结合，以ZH10株接种MDCK细胞，常规培养、洗涤、干燥、固定后加入4免后获得的抗血清及CDV标准阴性血清，作用洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG，以AEC显色。

1.12ELISA检测血清中抗H抗体用MDCK细胞大量增殖ZH10株病毒粒子，上清液离心浓缩纯化后作为诊断抗原。依照常规间接ELISA操作程序进行。在酶标仪上测定OD450nm值。

1.13SN检测血清中抗H抗体采用固定病毒-稀释血清法[4]。并设置病毒、血清毒性、阳性和阴性血清及空白细胞等对照组。

将病毒与血清的混合物接种MDCK细胞单层，最后接种病毒对照组。逐日记录CPE的出现情况。被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性，中和试验的结果是计算出能保护50%的孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为此血清中和抗体效价（滴度指P/N≥2.1时血清最大稀释倍数）。

2　结果

2.1重组真核表达载体pCI-H的酶切及PCR鉴定重组质粒pCI-H双酶切后，得到约1 824 bp和5 428 bp片段，单酶切线性化后得到大小约7 185 bp的DNA片段，与预期值大小一致（图1）；pCI-H 的H片段PCR扩增得到约1 824 bp片段，与H基因大小一致（图2）。表明重组质粒pCI-H构建成功。

图1　重组质粒pCI - H的酶切鉴定结果M1：DNA分子量标准（DL-2 000）；M2：DNA分子量标准（DL-15 000）；1：pcDNA3.1-H质粒；2：经Kpn I和Not I双酶切结果（约1 824 bp和5 361 bp）；3：经Kpn I单酶切结果（约7 185 bp）

2.2重组真核表达载体pCI-H DNA的提取和纯化经紫外分光光度计测定浓度为3.88 μg/μL，OD260/OD280值为1.96，琼脂糖凝胶电泳中超螺旋≥70%，说明所提质粒的浓度和纯度较好，可以满足转染和免疫动物的需要。

图2　重组质粒pcDNA3.1- H的PCR鉴定结果M：DNA分子量标准（DL-2 000）；1：pcDNA3.1-H的PCR扩增结果（1 824 bp）；2：阴性对照

2.3重组真核表达载体pCI-H在MDCK细胞中的表达及检测

2.3.1表达产物RT-PCR检测RT-PCR扩增的产物大小约为1 824 bp，与理论值相符。

2.3.2IIF检测pCI-H DNA转染的MDCK细胞胞浆内呈现特异性亮绿色荧光，而原载体DNA转染后未见上述荧光信号，表明该真核表达重组质粒在细胞表面可以正确高水平表达H蛋白，且表达产物有较好的反应原性。

2.3.3SDS-PAGE电泳及Western Blot检测结果显示，在pCI-H转染MDCK细胞样品中出现了大小约为84 kD的蛋白条带，且能与CDV多抗发生特异性反应，在蛋白印记中出现特异性条带，而对照没有相应的条带（图3）。这表明H蛋白获得了表达，并具有良好的反应原性。

图3　SDS- PAGE电泳（左）和Western Blot（右）检测H蛋白体外表达M：预染蛋白Marker；1：pCI -H转染MDCK细胞；2：pCI neo对照

2.4重组真核表达载体pCI-H的动物免疫原性试验

2.4.1IPMA试验如图4所示，病毒感染细胞与制备抗血清结合，细胞呈棕红色，而未接种的细胞无着色反应。表明该重组质粒在鼠体内获得正常表达，表达产物刺激机体产生的抗体能够与犬瘟热病毒结合。

2.4.2ELISA检测小鼠血清中的抗H抗体结果显示，pCI-H免疫小鼠抗体滴度达1∶28～1∶79，而原载体pCI（＋）质粒DNA为阴性，说明pCI-H能激发机体产生抗H抗体。

图4　IPMA试验结果（50×）a：病毒感染的MDCK-SLAM细胞；b：阴性对照

2.4.3免疫后诱导的血清中和抗体试验组所有小鼠均可检测出1∶11～1∶32的病毒中和抗体，而对照组均为阴性。证明pCI-H具有诱导产生血清中和抗体的能力。

3　讨论

H蛋白是CDV与细胞受体结合的蛋白，相对分子质量为76 000，存在于CDV膜表面，毒株不同其基因编码的氨基酸残基数也不同，CDV H蛋白有广泛而未被蛋白酶剪切的糖基化位点。一般认为H蛋白是产生中和抗体的主要靶抗原，具有细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位，能诱发特异

的CTL活性[1]，其在动物体内诱导的细胞免疫与高效价的中和抗体在抵抗CDV感染中具有重要意义，并与病毒的清除呈正相关[5]。有研究表明，CDV囊膜蛋白H免疫原性强于F[6]。

本试验将H基因克隆到pCI neo表达载体上，成功构建了重组真核表达载体pCI-H，在分子水平上成功转录与转译H基因，结果表明，pCI-H表达产物具有良好的反应原性。但免疫后的小鼠血清抗体滴度偏低，诱导的免疫反应较弱，可能是由免疫保护不足、基因表达水平低，免疫滞后等原因引起。由于未进行攻毒试验，对细胞免疫又未进行测定，所以目前尚难解释。此外，免疫操作及疫苗使用不当等诸多因素都会影响免疫效果，下一步需在这些方面加以探讨，以提高免疫诱导抗体水平。而关于反应原性不理想，图3所示的表达效率低，我们将会在载体设计以及H基因的分析与片段筛选上进一步优化。综上所述，pCI-H DNA重组疫苗能够诱导产生抗CDV的中和抗体，但抗体效价不足，有待进一步完善。

参考文献：

[1]赵建军，闫喜军，吴威.犬瘟热病毒基因变异及其细胞受体研究进展[J].微生物学报，2008，48（7）：986-991.

[2]袁颖烁，宋菲菲，张乐萃，等.犬瘟热病毒H蛋白的原核表达及免疫原性的初步鉴定[J].中国畜牧兽医，2013，40（4）: 41-44. [3]王好，钱爱东，刘晔，等.瘟热病毒疫苗株H蛋白基因片段的克隆与表达及表达产物抗原性的初步鉴定[J].中国预防兽医学报，2008，30（8）：601-604，611.

[4]黄祯祥，洪涛，刘崇柏.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990：142.

[5] Takahashi T，Tagami T，Yamazaki S，et al.Immunologic self-tolerance maintained by CD25＋CD4＋regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte e-associated antigen 4 [J].J Exp Med，2000，192（2）：303-310.

[6]高娃，杨敬，陈振文.犬瘟热病毒分子生物学研究进展[J].中国比较医学杂志，2004，14（4）：241-244.

A preliminary study of domestic popular caninedistemper vaccine

WU Ling，SUN Yu-hang，XU Chu-chu，LI Chang-sheng，XIA Cheng
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：The objective of this study was to determine the immunogenicity and antibody titer of the H protein.A recombinant eukaryotic expression plasmid pCI-H was constructed to initially study the immunogenicity of the expressed products.Subsequently the immune response induced by pCI-H DNA immunization was analyzed in mice.Results showed that the serum from the immunized groups with pCI-H could react with MDCK cells infected by virus and had specifically bright red fluorescence .The antibody tilters of ELISA could reach 1∶28 to 1∶79，and SN could be up to 1∶11 to 1∶32.The results suggest that H protein has the immunogenicity，However，it is insufficient to induce higher level of antibodies，and need to be further improved.

Key words：canine distemper virus；ZH-10 strain；H gene；eukaryotic expression；recombinant DNA vaccines

Corresponding author：XIA Cheng

通讯作者：夏成，E-mail：xcwlxyf@sohu.com

作者简介：吴凌（1966-），女，硕士，研究方向为预防兽医学，E-mail：wuling8@163.com

收稿日期：2014-05-28

中图分类号：S852.65+5

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0041- 03