刘倩宏，刘星宇，闫　峰，何玉华，魏　杰（.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林30；.广州白云机场出入境检验检疫局，广东广州50470）



基于RNA- seq识别布鲁菌酸调控候选基因

刘倩宏1，刘星宇2，闫峰1，何玉华1，魏杰1
（1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林132101；2.广州白云机场出入境检验检疫局，广东广州510470）

摘要：布鲁菌作为胞内寄生菌，在胞内生存面临很多压力。特别是感染早期，胞内的酸化是布鲁菌生存的必要条件。本试验利用RNA-seq，对正常培养条件、酸性培养条件的布鲁菌进行比较转录组学分析。结果表明，在酸性条件下113个基因表达发生显著变化（|log2Ratio|≥3），其中44%表达上调。经pathway分析，差异基因分布在51个通路，其中与布鲁菌胞内生存及毒力相关的通路有6个，分别是氧化磷酸化、离子转运、细菌分泌系统、转录调节系统、二元转运调控系统和ABC转运系统。布鲁菌对于酸性生存环境表现多通路、多基因的适应性变化，该研究为系统掌握酸调节基因奠定基础。

关键词：布鲁菌；转录组；RNA-seq；酸压力

布鲁菌病作为人兽共患病能引起野生动物、家畜和人类的感染。布鲁菌作为胞内寄生菌，面临着一系列的生存压力，比如营养缺乏、低渗透压、强氧化、低pH值等。特别是在感染的早期，酸性生存环境对布鲁菌的生存至关重要[1]。

目前已经认识的对酸性生存环境进行调控的基因及系统主要有IV型分泌系统（type IV secretion system，T4SS）、GAD系统（The glutamic acid decarboxylase，GAD）、Asp24蛋白、HdeA蛋白、脲酶及二元调控系统。布鲁菌在感染后被宿主的吞噬细胞吞噬，形成吞噬小体（Brucella-containing vacuole，BCV），BCV一直处于酸化环境。GAD系统在布鲁菌对抗酸化环境（pH值2.5）和小鼠口服感染布鲁菌的过程中都发挥作用。Asp24蛋白（24-kDa protein）由于在pH值4.0的环境下及感染的前3 h内（pH值在3.8至7.3之间变化）获得优势表达，表明该蛋白在对抗酸化环境中也发挥重要作用[2]。布鲁菌的脲酶由两个独立的基因群ure1和ure2构成。有研究表明，ure2在对抗酸性环境中发挥作用[3]。二元调控系统由转录反应子和转录效应子两部分组成，有研究表明，布鲁菌的mucR转录调节子在对抗酸性压力及发挥毒力方面都发挥作用。HdeA作为周质间隙蛋白，在低pH值条件下发挥作用，在大肠杆菌和志贺菌中都已得到证实。但究竟有多少基因参与到对酸性生存环境的调控中来，至今还缺乏全面系统掌握。

本研究利用RNA-seq对羊型布鲁菌16 M株在酸性培养环境及正常培养环境的转录组学变化进行了比较、分析，识别显著差异/富集的基因及通路，进一步丰富对于参与酸性调控基因的认识，为酸性调控基因的识别及绘制布鲁菌酸性调控网络奠定基础。

1　材料与方法

1.1所用菌株及培养条件将羊型布鲁菌16M株在胰酶大豆琼脂平板（TSA）上划线分离，于37℃5%CO2气体下培养3～4 d，挑取单菌落到胰酶大豆液体培养基（TSB）内增值到对数生长期，4℃保存备用。按1∶100稀释比例将母液导入到新鲜的TSB培养基内，培养至对数生长期，对菌液进行菌落计数。取0.5 mL菌液用pH值4.5的TSB洗涤1次，并重悬与等体积的pH值4.5的TSB混合，置于37℃孵育4 h。所有活菌操作均在吉林大学生物安全实验室完成。

1.2RNA提取将16M菌株培养于pH值7.0 TSB培养基，试验组菌株培养于pH值4.5 TSB培养基，其余培养条件相同。在试验条件下刺激4 h后，分别提取试验组（T group）、对照组（C group）细菌总RNA。提取RNA浓度、纯度用分光光度计检测合格后，送深圳华大基因公司测序。

1.3RNA-seq技术转录组学测序提取样品总RNA并使用DNase消化DNA后，去除rRNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。将mRNA随机打断成短片段，以打断后的mRNA为模板合成一链cDNA，然后合成二链cDNA，纯化回收，构建测序用文库。文库检测合格后，Illumina HiSeqTM2000测序仪测序。测序所得的数据称为总标签（raw reads/ raw data），对raw reads进行过滤得到净标签（clean reads）。clean reads质控检测合格后，进行基因表达、注释、及后续分析，并筛选出样品间差异表达基因，进行GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析。

1.4荧光定量RT-PCR用荧光定量试验进行验证部分测序结果。选取与布鲁菌胞内生存及毒力相关通路中的25个显著差异基因进行验证。T组、C组总RNA提取操作同上。具体操作根据荧光定量RT-PCR试剂盒进行。反应体系为20 μL，扩增条件如下：95℃10 min，95℃15 s，45个循环，60℃或58℃30 s，最后72℃30 s。反应在ABI公司stepone plus系统运行，16s rRNA作为内参，利用2-ΔΔct值计算不同基因相对转录水平。试验重复3次，试验所用引物略1。

2　结果

C组和T组分别获得了6886380和6697942个总标签（raw reads/raw data）。经比对，在C组与T组间共获得1 250个差异表达基因（FDR≤0.001 and |log2Ratio|≥1）。其中，457个基因表达上调，793个基因表达下调。在这1 250个基因中显著差异的基因（|log2Ratio|≥3）有113个，其中50个基因上调，63个基因下调（结果略）。

2.1GO term显著性富集分析通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。在所处的细胞位置本体中，核糖体和核糖核蛋白复合体是显著富集的GO term（pvalue≤0.05）；在所处的基因分子功能本体中，核糖体的结构成分、RNA结合、结构分子活性是显著富集的GO term（p-value≤0.05）；在所处的参与生物过程本体中，细胞大分子生物合成是显著富集的GO term（p-value≤0.05）。

2.2pathway显著性富集分析在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于通路（pathway）的显著性富集分析能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。结果发现，51个pathways表现显著性富集，其中核糖体和光合作用两个通路的变化最显著（Q-value≤0.05）。经分析，有6个pathways、33个基因与布鲁菌毒力及胞内生存紧密相关，具体见表1。

在氧化磷酸化通路中有6个基因的表达发生显著变化，并且全部下调（图1）。BMEII0248，BMEI0249，BMEI0250和BMEI0251四个基因在序列上紧密连接，并且BMEI0251基因还同时出现在细菌入侵上皮细胞（bacterial invasion of epithelial cells）通路和光合作用和肽聚糖生物合成通路中；BMEI1545和BMEII0248基因也重复出现在光合作用通路中。在离子转运通路中有3个基因的表达发生显著差异，只有BMEII0704（编码产物是细菌铁蛋白）基因下调（表1）。在ABC转运通路中有3个基因的表达出现显著差异，BMEII0607基因上调。在分泌系统通路中有8个基因的表达发生了显著差异（llog2Ratio|≥3），并且表达下调（表1）。在转录调节通路中有9个基因的表达发生显著变化，除了BMEI1026、BMEI0454和BMEII0036基因的表达上调外，其余5个基因全部下调（表1）。在二元调控系统通路中有4个基因的表达发生显著差异，BMEI1596和BMEI1646基因表达上调（表1）。

表1　与布鲁菌毒力及胞内生存相关的显著变化基因及所处通路

2.3荧光定量PCR结果

为了验证RNA-seq测序结果，随机选取25个基因进行荧光定量RT-PCR试验。结果表明，18个基因的表达趋势出现了一致的结果，两种技术的相符率达到72%（图1）。

3　讨论

布鲁菌分泌系统中，virB2，virB3，virB4，virB5，virB6，virB8，virB9，virB10和virB11对于流产布鲁菌在小鼠体内发挥毒力是必需的。资料表明，virB12在感染期间能够持续表达，但在本研究中virB12基因的表达没有发生显著变化。T4SS中的8个基因都表现下调（表1），这些基因在布鲁菌的胞内生存的调节中可能发挥负调控的作用。金属离子在构成蛋白和细胞成分上发挥重要作用，同时对细胞代谢和细菌生理提供微量营养[4]。本研究中，BMEII0704基因（编码产物是细菌铁蛋白）显著下调，可能对细菌铁蛋白合成产生影响，这可能是对酸性生存环境做出的适应。BMEI0668基因（被命名为Asp24，其编码产物是钙联蛋白）表达显著上调，这可能是对酸性生存环境的一种代偿性对抗，这与Fichat A等人的报道相符[2]。钙联蛋白在细胞功能发挥及信号传导等方面广泛发挥作用。

ABC转运子编码abcEDCBA或转运亚基，转运亚基在T4SS表达和避免与溶酶体接触上发挥重要作用[5]。ABC转运子的ATP酶被失活后，布鲁菌S2308株的毒力显著下降。ABC转运子通路中的基因表达发生显著变化，这可能是受酸性生存环境的调节，也可能在布鲁菌的胞内生存及毒力上发挥作用。氧化磷酸化能满足布鲁菌的能量需要，在营养缺乏的条件下，布鲁菌要降低自身的代谢水平以适应自己所处的压力环境。在本研究中，氧化磷酸化通路中所有基因都下调，这可能是细菌降低了自己的能量代谢水平以适应生存的酸性环境。

图1　荧光定量RT- PCR与RNA- seq结果比较

布鲁菌的转录调节子是毒力因子，还紧密调节一些编码金属输入、输出及存储系统功能基因的表达。MarR转录调节子可以通过调节virB启动子来控制毒力，GntR转录调节子在感染细胞内对毒力调节也发挥重要作用。热激蛋白作为分子伴侣能保护细菌对抗细胞的压力，比如热激等，在蛋白的折叠及转运方面也广泛发挥作用。布鲁菌的HSPs同时还具有良好免疫原性，被广泛用作基因工程疫苗及保护性抗原的研究。布鲁菌的外膜蛋白由于具有良好的抗原特性及高度的保守性也被广泛用作疫苗候选者及诊断性抗原的研究。布鲁菌的二元调控系统在细菌的毒力、胞内生存及对抗压力等方面发挥重要作用，FeuP/FeuQ、BvrS/BvrR、NtrB/NtrC、NtrX/Ntr Y、LOV-HK、CenR、PrlS/PrlR及MucR等二元调控系统已被广泛报道，但在本研究中这些二元调控系统的基因没有发生显著变化。

本研究通过比较转录组学方法，识别113个在酸性生存环境中发生显著表达的基因，并对这些显著差异表达基因进行了GO term及pathway分析。结果表明，布鲁菌在胞内寄生，不是某个基因、而是多个基因相互作用构成一个有机调控的网络在发挥作用，该菌对酸性生存环境表现出多系统、多基因的变化及适应。

参考文献：

[1] F Porte，Liautard J P . Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages[J].Infect Immun，1999，67（8）：p.4041-4047.

[2] Lin J，Tomas Ficht.Protein synthesis in Brucella abortus induced during macrophage infection[J] . Infect Immun，1995，63（4）：p. 1409-1414.

[3] Sangari F J.Brucella abortus ure2 region contains an acid-activated urea transporter and a nickel transport system [J].BMC Microbiol，2010，10：p.107-112.

[4] Waldron K J.Metalloproteins and metal sensing[J].Nature，2009，460（7257）：823-830.

[5] Silva T M.The predicted ABC transporter AbcEDCBA is required for type IV secretion system expression and lysosomal evasion by Brucella ovis[J].PLoS One，2014，9（12）：p.e114532.

Identifying Candidate Genes of Acid Regulation Genes of BrucellaBased on RNA- seq

LIU Qian-hong1，LIU Xing-yu2，YAN Feng1，HE Yu-hua1，WEI Jie1
（1.Jilin Agricultural Science and Technology University，Jilin 132101，China；2.Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection and Quarantine Brueau of P.R.C，Guangzhou 510470，China）

Abstract：Brucella melitensis，a facultative bacteria，encounters a very stressful environment in phagosomes，especially at low pH levels.In our study，comparative transcriptomes with RNA-seq were used to analyze the changes of genes in normal-medium culture and in pH4.4-medium culture.The results revealed that 113 genes expressed with significant differences（|log2Ratio|≥3），and about 44%genes expressed as up-regulated .These genes distributed in 51 pathways，in which ribosome and photosynthesis pathways were significantly enriched .Six pathways（oxidative phosphorylation，iron-transporting，bacterial secretion system，transcriptional regulation，two-component system，and ABC transporters pathways）tightly related to the intracellular survival and virulence of Brucella were analyzed. Global changes involved in many pathways and genes were adapted to the acidic environment of Brucella.

Key words：Brucella melitensis；comparative transcriptomes；RNA-seq；acid strss

作者简介：刘倩宏（1973-），女，副教授，博士，从事布鲁菌病的相关研究，E-mail：qianhongliu@126.com

基金项目：吉林省科技厅项目（20130101113JC）；吉林农业科技学院种子基金项目（X906）

收稿日期：2015-11-26

中图分类号：S852.61

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0034- 04