高云航，赵是钧，赵晗旭，王　开，娄玉杰，马红霞（.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春308；2.吉林农业大学动物生产与产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春308）



不同方法提取的复方中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响

高云航1，2，赵是钧1，赵晗旭1，王开1，娄玉杰1，马红霞1，2
（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物生产与产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118）

摘要：为了研究复方中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响，为开发提高母畜泌乳量的中草药产品奠定基础，使用混合酶消化法分离培养妊娠中期小鼠乳腺上皮细胞，通过SDS-PAGE对纯化后细胞进行鉴定。使用水煎和醇提两种方法提取的复方中药提取液分别作用于对数期乳腺上皮细胞1、3、5 d，使用MTT法检测细胞活力。结果使用混合酶消化法得到大量乳腺上皮细胞。不同方法提取的中药复方提取液在高浓度时促进细胞增殖，在低浓度时抑制细胞增殖。促进作用随作用时间增加而降低。表明醇提中药复方促进细胞增殖的浓度范围大于水煎中药复方，且醇提的中药复方作用效果优于水煎中药复方。

关键词：中药提取物；乳腺上皮细胞；增殖影响

我国养殖业长期面临仔畜存活率低的问题，而母畜的泌乳量不足是造成该问题的主要原因。人们通过使用激素来提高母畜泌乳量。随着食品安全事件的不断发生，为了获得安全、无污染的绿色食品，人们将目光转向传统中草药。有些中草药具有增强机体免疫力、提高母畜泌乳量的药效作用，同时具有无残留、无污染等优点。本试验拟从妊娠中期孕鼠体内分离培养乳腺上皮细胞，将自主配制的促乳中药复方分别以水煎和醇提两种方法提纯，并以不同浓度添加到细胞培养液中，使用MTT法检测不同方法提纯的中草药对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响，筛选出增殖效果最佳的中药复方。如果在生产实践中找到提高母畜泌乳量、补充母畜营养的中药复方制剂，将为开发提高母畜泌乳量的中草药产品奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验动物的选择清洁级ICR妊娠中期孕鼠。

1.2复方中药提取液的制备中药复方一：王不留行、黄芪、党参、熟地、甘草、当归、白术；中药复方二：黄芪、当归、王不留行、漏芦、川木通、路路通、红花、丹参。复方1和复方2分别用水煎和醇提两种方法进行提取，用DMEM/ F12培养基配制中药原液。

1.3试验方法将孕鼠乳腺组织剪碎，加入适量混合酶[1]。消化1.5 h后过滤，将滤液以1 000 r/min离心10 min，取上清再次离心后弃上清，向离心管中加入适量DMEM/F12培养液，用150目细胞筛过滤后收集滤液，将滤液以1 000 r/min离心10 min，弃上清，用培养液重悬细胞团。将悬浮细胞置于培养箱中培养4 h后，水平晃动使沉淀的乳腺上皮细胞悬浮，离心弃上清，用完全培养基（含胎牛血清10%、氢化可的松5 μg/mL、IGF-1 10 μg/mL、EGF 10 g/mL、胰岛素5 mg/mL、双抗100 IU（μg）/mL，调pH值7.2）重悬细胞，并且将细胞吹打均匀，培养箱培养。使用相差消化和相差贴壁法对分离的乳腺上皮细胞进行纯化，经2～3代后获得较纯细胞。

1.4乳腺上皮细胞的鉴定将纯化后细胞置于显微镜下观察，并且收集培养5 d的细胞上清液通过SDS-PAGE电泳对乳腺上皮细胞进行酪蛋白检测，同时以酪蛋白标准品为阳性对照，以成纤维细胞上清液为阴性对照，完全培养液为空白对照。

绘制纯化后细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间。群体倍增时间＝t×lg2/（lgNt-lgNo）t：消化细胞时间；Nt：培养t小时细胞平均数；No：接种细胞数。

1.5中草药提取物对乳腺上皮细胞增殖的影响

据相关文献[2-4]使用完全培养基将水煎和醇提4种中药复方分别稀释成药物浓度为400、200、100、50、25 mg/mL及10 mg/mL的溶液。用完全培养液将细胞制成单细胞悬液，接种密度为1×105个/mL，每孔接种100 μL，置于培养箱中培养。48 h后向96孔板内加入含有不同浓度中药提取液的培养液，设对照组。于1、3、5 d后吸出孔内培养液，每孔加20 μL MTT溶液，放入培养箱内孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL的DMSO，室温振荡10 min，使结晶物质充分溶解。

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，P＜0.05认为有统计学意义。

2　结果

2.1小鼠乳腺上皮细胞形态鉴定结果使用混合酶法分离培养的乳腺上皮细胞在培养24 h后，发现大部分细胞团已经贴壁生长，如图1。96 h时，呈铺路石状，如图2。当乳腺上皮细胞数量较多时，呈岛屿状生长，当细胞数量较少时各细胞的凸起和细胞外基质会形成拉网状结果，如图3、4。

图1　原代培养24 h后贴壁的细胞团（×200）

图2　96 h后呈片生长并且边界明显成铺路石状（×200）

图3　呈岛屿状的乳腺上皮细胞（×200）

图4　呈拉网状的乳腺上皮细胞（×200）

2.2小鼠乳腺上皮细胞分泌物鉴定结果SDSPAGE电泳表明，乳腺上皮细胞上清液中所含的蛋白与酪蛋白标准品分子质量相同，说明细胞分泌物中含有酪蛋白，证明所分离培养细胞是具有正常分泌功能的乳腺上皮细胞。

图5　SDS- PAGE检测结果A：蛋白质标准品；B：酪蛋白标准品；C：成纤维细胞上清液；D：培养液；E：乳腺上皮细胞上清液

2.3小鼠乳腺上皮细胞的生长曲线和群体倍增时间结果乳腺上皮细胞生长曲线呈“S”型。在接种后2～7 d处于增殖状态，且该细胞群体倍增时间在第5天最短。因此选取培养4～6 d的细胞进行消化计数，可知该细胞倍增时间为60.8 h。

图6　乳腺上皮细胞生长曲线

2.4中药复方提取物对小鼠乳腺上皮细胞的作用结果水煎复方一在浓度为200～400 mg/mL时对小鼠乳腺上皮细胞增殖作用显著；水煎复方二在浓度为200～400 mg/mL时对乳腺上皮细胞增殖作用显著。醇提复方一在浓度为25～400 mg/mL时对乳腺上皮细胞增殖作用显著，且在浓度为400 mg/mL时增殖作用最强。醇提复方二在浓度为100～400 mg/mL时对乳腺上皮细胞增殖作用极显著（P＜0.01），表1～3。

2.5中药复方对小鼠乳腺上皮细胞增殖率的影响随着药物作用时间的增加对乳腺上皮细胞增殖作用降低。在复方提取液浓度为400 mg/mL时乳腺上皮细胞的增殖率最大。醇提中药复方对乳腺上皮细胞增殖率的影响大于水煎中药复方，图7～10。

表1　中药复方提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响（1 d）

表2　中药复方提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响（3 d）

表3　中药复方提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响（5 d）

3　结论与讨论

3.1小鼠乳腺上皮细胞体外培养试验最初接种细胞数为1×105个，但在2 d后乳腺上皮细胞才开始增殖，说明乳腺上皮细胞潜伏期较长，可能乳腺上皮细胞在潜伏期内主要参与活动是贴附过程。进行生物学检测试验最适宜时期为对数生长期，本试验细胞的对数生长期从第3天到第6天，其细胞群体倍增时间为60.8 h，比文献[5]中提早2 h，可能是试验过程中使用混合酶消化以及在纯化过程中使用EDTA孵育的原因，本试验在分离乳腺上皮细胞过程中降低了胰蛋白酶浓度，可以减少细胞损伤，增强原代细胞活力。在纯化过程中使用EDTA孵育同样减少了胰蛋白酶作用时间，从而降低了胰蛋白酶的不利因素，所以倍增时间减少。

图7　水煎中药复方一对乳腺上皮细胞增殖率的影响

图8　水煎中药复方二对乳腺上皮细胞增殖率的影响

图9　醇提中药复方一对乳腺上皮细胞增殖率的影响

图10　醇提中药复方二对乳腺上皮细胞增殖率的影响

3.2中药复方对小鼠乳腺上皮细胞的增殖和抑制作用本试验采用中药复方提取物直接刺激乳腺上皮细胞，发现其对小鼠乳腺上皮细胞具有高浓度促进细胞生长，低浓度抑制生长的双重作用，与周凡报道相符[6]。但中药提取物促进细胞增殖的浓度有所差异，并且药物作用效果随作用时间增加而变化，高浓度药物随着作用时间增加，促进增殖的效果逐渐降低，低浓度药物随作用时间的增加其抑制增殖效果越明显。同时醇提中药复方对乳腺上皮细胞的增殖效果优于水煎中药复方，与通常服药方式相悖。提示本试验中药复方的中药成分可能为醇溶性。

本试验通过体外刺激乳腺上皮细胞可以在一定程度反应复方中药的作用机理，对复方中药促进母畜泌乳机理的研究提供了试验基础。但在中药复方促进乳腺上皮细胞药物的有效成分和促进细胞增殖的信号通路等方面尚待进一步研究。

参考文献：

[1]易琼，王鲁，李圆方，等.改良型混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2012，15（50）：9335-9338.

[2]李悦山，张建龙，薛垒.黄茂与当归对人脐静脉内皮细胞增殖及VEGF表达的影响[J].新疆医科大学学报，2005，28（3）：224-227.

[3]张团笑，牛采琴，秦晓民.王不留行对家兔离体主动脉环张力的影响及其机制[J].中药药理与临床，2004，20（4）：28-29.

[4]吕文科，弊睿，晓梅.漏芦黄酮对成骨细胞的体外毒性试验研究[J].中医骨伤科杂志，2006，4（1）：42-44.

[5]王希春，周凡，冯士彬.中草药提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响[J].西北农林科技大学学报，2011，39（7）：15-20，27.

[6]周凡.中草药提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖作用的研究[D].合肥：安徽农业大学，2010.

Effect of compound herbal extracts on mouse mammary epithelial cells by different methods

GAO Yun-hang1，2，ZHAO Shi-jun1，ZHAO Han-xu1，WANG Kai1，LOU Yu-jie1，MA Hong-xia1，2
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Key Laboratory of Animal Production，Product Quality and Security，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Abstract：To study the effect of Chinese medicine extracts on mice mammary gland epithelial cell proliferation .Using mixed enzyme digestion method to mouse mammary gland epithelial cells.Decoction and alcohol extraction methods were used to get the Chinese medicine extracts，and then use the extracts to treat the logarithmic phase mammary gland epithelial cells .At 1 day，3 days，and 5 days later，cell viability was determined by MTT method.Using mixed enzyme digestion method，we successfully got mammary gland epithelial cells.Extracts of traditional Chinese medicine in high concentration promoted cell proliferation，and inhibited cell proliferation in low concentration.Promoting effect was decreased with increasing time.Alcohol extraction of traditional Chinese medicine compound promotes cell proliferation in the concentration range is greater than the water decoction of traditional Chinese medicine.Alcohol extraction of traditional Chinese medicine is much better than the decoction of traditional Chinese medicine，probably because the ingredients are soluble in alcohol.

Key words：Extract of Chinese medicine；Mammary gland epithelial cells；Proliferation

Corresponding author：MA Hong-xia

通讯作者：马红霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

作者简介：高云航（1975-），男，副教授，博士，从事动物疫病防治研究，E-mail：gaoyunhang@163.com

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-44-E-6）；吉林省科技发展计划项目（20100230）；吉林省现代农业产业技术体系建设专项

收稿日期：2014-05-27

中图分类号：S853.72

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0027- 04