林祥超，高志强，张鹤晓，张　康，郭金玉，牛建蕊，张乐萃（.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛6609；.北京出入境检验检疫局，北京通州0006；.北京森康生物技术开发有限公司，北京怀柔000；.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州70050）



猪圆环病毒2型ORF- 2全基因重组腺病毒的构建与鉴定

林祥超1，高志强2，张鹤晓2，张康3，郭金玉1，牛建蕊4，张乐萃1
（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；2.北京出入境检验检疫局，北京通州100026；3.北京森康生物技术开发有限公司，北京怀柔101400；4.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州730050）

摘要：扩增猪圆环病毒2型的ORF-2全基因（702 bp），将目的片段与缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-NpA连接，构建重组穿梭质粒CMV-ORF-2。将穿梭质粒与骨架质粒pacAd5 9.2-100经限制性内切酶Pac I线性化后共转染293T细胞，进行细胞内重组。7～15 d后获重组腺病毒rAd5 CMV-ORF-2与对照组重组腺病毒rAd5 CMV-GFP。使用293细胞进行病毒增殖，对增殖稳定的rAd5 CMV-ORF-2进行鉴定；rAd5 CMV-ORF-2 TCID50为107.5/50 μL，用该代次rAd5 CMV-ORF-2进行PCV-2阳性血清中和试验，结果表明，重组腺病毒成功，PCV-2阳性血清不能中和重组腺病毒。

关键词：猪圆环病毒2型；ORF-2；缺陷型重组腺病毒

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV），依据病毒的核酸序列差异可将病毒分为猪圆环病毒1型（PCV-1）和猪圆环病毒2型（PCV-2）。PCV-2是引发断奶仔猪多系统消耗综合征（post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），猪皮炎与肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）等疾病的主要病原[1]。在PCV-2型的基因序列中ORF-1和ORF-2是两个主要阅读框。ORF-1编码的Rep蛋白与病毒的复制相关，ORF-2编码Cap蛋白，是PCV-2的主要结构蛋白，并具有特异性表位，能够刺激机体产生保护性抗体[2]。因此，PCV-2型的ORF-2 Cap蛋白被广泛研究应用于PCV-2型的检测与疫苗的研发[3]。

随着腺病毒作为载体研究的日益完善，其自身感染宿主细胞广泛，病毒滴度高，安全性好等优点在基因工程疫苗领域得到广泛关注[4]。近年来的各项研究表明，缺陷型人5型重组腺病毒载体表达蛋白用于疫苗研制具有良好的应用前景[5]。因此，结合复制缺陷型腺病毒载体，进行PCV-2 Cap蛋白的表达，为进一步研制PCV-2型新型疫苗提供参考数据。

1　材料与方法

1.1主要材料和试剂PCV-2型阳性病料、PCV-2阳性血清、293T、293细胞株由青岛农业大学保存；复制缺陷型腺病毒表达系统RAPAd®CMV Adenoviral Expression System，购自美国Cell Biolabs公司。

1.2引物依据GenBank多组PCV-2序列，设计扩增引物：P1：5′-GGGGTACCATGGCGTATCCAAG GAGGCGTTACC-3′酶切位点Kpn I；P2：5′-CCCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3′酶切位点Hind III。

1.3T-ORF-2重组质粒的构建提取阳性病料中PCV-2 DNA，使用扩增引物进行ORF-2扩增，扩增产物ORF-2与T-Vector pMD-19连接，构建T-ORF-2重组质粒，对T-ORF-2进行测序。

1.4重组腺病毒的构建、包装与增殖连接腺病毒穿梭载体pacAd5 CMV K-NpA与ORF-2，获得重组腺病毒穿梭载体CMV-ORF-2。对CMVORF-2进行双酶切、测序鉴定后，使用Pac I酶线性化CMV-ORF-2、对照穿梭质粒CMV-GFP及骨架质粒pacAd5 9.2-100，分别转染293T细胞，转染7～15 d出现明显病变，收获重组腺病毒P0，使用293细胞进行病毒增殖，获得增殖稳定的重组腺病毒rAd5 CMV-ORF-2与对照组重组腺病毒rAd5 CMV-GFP。

1.5重组腺病毒rAd5 CMV-ORF-2鉴定提取rAd5 CMV-ORF-2、rAd5 CMV-GFP、健康293细胞总RNA，使用扩增引物进行RT-PCR鉴定。

1.6Westen Blot鉴定取rAd5 CMV-ORF-2接毒细胞、rAd5 CMV-GFP接毒细胞和健康293细胞混合SDS Buffer后沸水煮10 min，SDS-PAGE电泳后进行Western Blot鉴定。

1.7TCID50的测定与阳性血清中和试验取P7 代rAd5 CMV-ORF-2，对照组rAd5 CMV-GFP病毒液进行TCID50测定。根据TCID50测定结果，进行rAd5 CMV-ORF-2、rAd5 CMV-GFP中和试验。

2　试验结果

2.1ORF-2扩增与T-ORF-2双酶切结果扩增获得大小为702 bp的目的片段（见图1），重组穿梭质粒CMV-ORF-2双酶切得到大小为702 bp的目的片段（见图2），与预期大小相符。CMV-ORF-2与T-ORF-2测序结果一致，与国内分离株（AY424401.1）核苷酸序列同源性为100%。另外，使用腺病毒载体扩增引物CMV-F进行通测，腺病毒载体序列正确，无移码、突变、缺失，保证了重组目的片段ORF-2的正确表达。

图1　ORF- 2基因扩增MI：DL-2 000；1：扩增ORF-2全基因PCR产物；2：阴性对照

图2　CMV- ORF- 2质粒双酶切M1：DL-15 000；M2：DL-2 000；1：CMV-ORF-2双酶切结果；2：PCV-2病毒DNA扩增结果

2.2RT-PCR鉴定结果rAd5 CMV-ORF-2组提取RNA扩增目的条带与CMV-ORF-2扩增条带大小一致（702 bp）。rAd5 CMV-GFP与健康293细胞提取RNA无扩增条带（见图3），证明重组腺病毒能够有效感染宿主293细胞，进行有效转录。

2.3Western Blot鉴定结果SDS-PAGE试验未见明显特意条带，Western Blot结果可见大小为30kD左右的目的蛋白（见图4），蛋白大小与PCV-2-ORF-2 Cap蛋白大小相符，因此，目的蛋白能够真核表达，且具有良好的反应原性。

2.4TCID50测定与中和试验结果10-6稀释度全部病变，10-7稀释度有3孔出现病变，依据Reed-Muench法计算，P7代rAd5 CMV-ORF-2的TCID50为107.5/50 μL。使用多份PCV-2阳性血清进行中和试验。试验表明，PCV-2阳性血清不能中和rAd5 CMV-ORF-2。

图3　RT- PCR鉴定1：rAd5 CMV-GFP组细胞；2：rAd5 CMV-GFP扩增结果；3：CMV-ORF-2扩增产物；M：DL-2 000；4：健康293细胞扩增结果

图4　Western- Blot鉴定1：rAd5 CMV-ORF-2扩增结果；2：健康293细胞；3：rAd5 CMV-ORF-2接毒细胞；M：蛋白预染Marker

3　讨论

PCV-2-ORF-2编码PCV-2核衣壳Cap蛋白，是PCV-2的主要免疫性蛋白。因此，在PCV-2诊断与疫苗研制方面具有重要地位[6]。研究表明[7]，PCV相同基因型不同毒株间序列同源性大于90%，不同基因型毒株间同源性仅为68%～79%，各个国家存在的PCV也存在较大差异[8]。本试验中，从阳性病料中分离获得的PCV-2型与国内分离株（AY424401.1）碱基同源性为100%，但与其他PCV-2毒株还存在差异。

腺病毒包装与增殖过程中发现，293T细胞的转染效率较293细胞高，但病毒增殖效率很低，而293细胞的转染率较低。因此，选择用293T细胞进行转染，293细胞进行增殖。试验表明，效果较好，病毒滴度最高能够达到108.37/50 μL TCID50。实验发现，转染包装阶段细胞代次及细胞状态至关重要。建议使用代次低，状态好的细胞进行。在病毒收获时发现，上清中存在重组腺病毒，且病毒含量低于细胞中病毒含量，因此，在进行病毒增殖过程中，为了能够更快达到病毒扩增效果，离心收集接毒细胞进行反复冻融作为母液进行前期下一代扩增，在病毒毒力稳定后，仅收集细胞毒量与收集细胞与培养基混合液毒力差别不大。

在TCID50测定中，病毒在10-8稀释度时已不能引起细胞病变，但在相同稀释度的对照组rAd5 CMV-GFP，仍能够观察到有荧光，因此在病毒浓度或含量较低的情况下，可使用建立的荧光定量PCR方法进行鉴定（此方法待发表），在10-9稀释度时仍能准确检测出病毒，适合病毒增殖初期时的检测，也可以比较直观的观察病毒增殖情况。

使用PCV-2阳性血清不能中和重组腺病毒，这可能与腺病毒表达的靶蛋白不存在于重组病毒粒子表面有关，避免了母源抗体对PCV-2重组疫苗免疫效果的干扰。近年来，腺病毒已经广泛应用于人类基因治疗中[5]，并且在自然条件下猪体内不存在针对人5型腺病毒载体的特异性抗体，避免其他免疫原对机体产生的刺激和影响。因此，腺病毒作为疫苗载体及相关诊断方法的研究将有良好的前景与优势。

参考文献：

[1] Lekcharoensuk P，Morozov I，Paul P S，et al.Epitope mapping of the major capsid protein of type2 porcine circovirus（PCV2）by using chimeric PCV1 and PCV2[J].J Virol，2004，78：8135-8145.

[2] Jizong Li，Tianqi Yu，Xiaobo Wang，et al.Comparative efficacy of experimental inactivated and live- attenuated chimeric porcine circovirus（PCV）1-2b vaccines derived from PCV1 and PCV2b isolates originated in China[J].Virology journal，2015，12：113-124. [3] Kamstrup S，Barfoed A M，Frimann T H，et al . Immunisation against PCV2 structural protein by DNA vaccination of mice[J] . Vaccine，2004，22：1358-1361.

[4] Basavaraj Binjawadag，Varun Dwived，Cordelia Manickam，et al. Adjuvanted poly（lactic-co-glycolic）acid nanoparticle-entrapped inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine elicits cross-protective immune response in pigs[J] .International Journal of Nanomedicine，2014，9：679-694.

[5] Pogranichnyy R M，Yoon K J，Harms P A，et al.Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection[J].Viral immunol，2000，13：143-153.

[6] Liu J，Chen I，Du Q，et al.The ORF3 protein of porcine circovirus type 2 is involved in viral pathogenesis in vivo[J] . J Virol，2006，80（10）：5065-5073.

[7] Nawagitgul P，Morozov I，Bolin S R，et al.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J] . J Gen Virol，2000，81（Pt 9）：2281-2287.

[8] Piñeyro PE1，Kenney SP2，Giménez-Lirola LG，et al.Expression of antigenic epitopes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in a modified live-attenuated porcine circovirus type 2（PCV2）vaccine virus（PCV1-2a）as a potential bivalent vaccine against both PCV2 and PRRSV[J] . Virus Research，2015，210：154-164.

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Containing the ORF- 2 Complete Geneof Type2 Porcine Circovirus

LIN Xiang-chao1，GAO Zhi-qiang2，ZHANG He-xiao2，ZHANG Kang3，GUO Jin-yu1，NIU Jian-rui4，ZHANG Le-cui1
（1.Animal Science and Technology College，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China；3.Beijing Senkang Biotech Development Co.，Ltd，Beijing 101400，China；4.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS，Lanzhou 730050，China）

Abstract：The 702 bp ORF 2 of PCV-2 was amplified and cloned into the defective adenovirus shuttle plasmid pacAd5 CMV K-NpA to construct recombinant shuttle plasmid CMV-ORF2.The shuttle plasmid and backbone plasmid pacAd5 9.2-100 were linearized using the restriction enzyme Pac I，and were then cotransfect into 293T cells.The ORF2 complete genome recombinant adenovirus rAd5 PCV-2 and the control CMV-GFP recombinant adenovirus rAd5 were obtained 7 to 15 days later.The recombinant viruses were propagated and identified in 293 cells . The recombinant viruses were stable in propagation and the TCID50of rAd5 CMV-ORF2 was 107.5/50 μL.The PCV-2 positive sera and rAd5 CMV-ORF2 were used in neutralization test.The results showed that the construction succeeded and PCV-2 positive sera could not neutralize the recombinant adenovirus.

Key words：Porcine circovirus type 2；ORF-2；Defective recombinant adenovirus

Corresponding author：ZHANG Le-cui

通讯作者：张乐萃，E-mail：lczhang@qau.edu.cn

作者简介：林祥超（1989-），女，硕士生，研究方向为动物病毒学，E-mail：muyangzhao@126.com

基金项目：质检公益性行业科研项目（201310253）

收稿日期：2015-08-26

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0024- 03