隆林　范红梅　周丽

【摘 要】 目的：建立兴仁金线莲HPLC指纹图谱。方法：采用Phenomenex C18 （4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B）梯度洗脱程；流速：1.0ml/min；检测波长：327nm；柱温：30℃。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）进行指纹图谱分析。结果：分别优化了检测波长、流动相以及HPLC色谱梯度洗脱条件，标定了20个共有指纹特征峰，确定了以槲皮素、山柰素和异鼠李素3个化合物，建立了12个不同批次的兴仁金线莲HPLC指纹图谱，相似度较高。结论：该方法方法学考察符合指纹图谱技术要求，为兴仁金线莲质量控制提供依据。

【关键词】 兴仁金线莲；指纹图谱；槲皮素；山柰素；异鼠李素；高效液相色谱法

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0040-05

Abstract：Objective To establish a HPLC fingerprint of Anoectochilus xingrensis. Methods The chromatographic separation was performed on a Phenomenex C18 column （4.6×250mm， 5μm）， mobile phase was acetonitrile-0.4%phosphoric acid. and the separation process was carried out using a gradient elution， the corresponding concentration gradient of acetonitrilewhich was based on a mobile phase of the mixture solution with acetonitrile （A） - 0.4% phosphoric acid （B） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 327nm， and the column temperature was 30℃. The chromatographic fingerprints were analyzed with the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM （2004A edition）. Results Totally 20 common fingerprint peaks and 3 constituents including quercetin， kaempferide and isorhamnetin were identified after optimization of the detection wavelength， mobile phase and HPLC chromatography gradient elution conditions. Furthermore， the similarity of HPLC fingerprints of 12 different batches of Anoectochilus xingrensis was high.Conclusion The present methodology meets the technical raquirements of fingerprint and could be a basis for the intrinsic quality control standard for Anoectochilus xingrensis.

Keywords：Anoectochilus Xingrensis；Fingerprint；Quercetin；Kaempferide；Isorhamnetin；HPLC

兴仁金线莲（Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin）是吉占和、金效华等在贵州兴仁等地发现并命名的新种[1]，为兰科（Orchidaceae）开唇兰属多年生草本植物。该植物民间用于冶疗高血压、高血脂、糖尿病、肿瘤、肺结核咳血、重症肌无力、肝炎、肾炎、小儿急惊风、风湿性及类风湿性关节炎、妇女白带以及毒蛇蛟伤等症，素有“药王”、“金草”、“神草”、“乌人参”等美称，全草入药。

兴仁金线莲主要分布于贵州省黔西南州，其植株比其他金线莲大，产量高，资源非常丰富，属于地产药材。近年来，人们对药食同源有了更近一步的理解，兴仁金线莲开始出现在高挡及野味餐馆的桌面上。目前，对兴仁金线莲的鉴别仅局限于植物形态上，全凭经验，极难区分。鉴于其具有较高的药用价值及经济价值，研究应用HLPC法，建立指纹图谱，为兴仁金线莲的资源开发及质量评价提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AD高效液相色谱仪（含LC-20AD二元泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-M20A检测器）；日本岛津AUY220电子天平（万分之一）；赛多利斯CPA2250电子天平（十万分之一）；电热恒温干燥箱（上海博讯实验有限公式医疗设备）；数显恒温水浴锅（江苏金坛市中大仪器厂）。

1.2 试剂试药 槲皮素（批号：100081-200907）、山柰素（批号：110861-200606）、异鼠李素（批号：110860-201109）均由中国药品生物制品检定所提供。兴仁金线莲由兴义师范学院周丽副教授提供，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18 （4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0→5→10→30→45→70→80→85min，乙腈（A）对应的浓度梯度5%→10%→20%→25%→30%→40%→5%→5%；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10uL；检测波长：327nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素10.39mg，加甲醇定容至100ml量瓶中，取3ml于同一25ml量瓶中； 精密称取山柰素8.58mg，加甲醇定容至50ml量瓶中，取1ml于同一25ml量瓶中；精密称取异鼠李素8.58mg，加甲醇定容至100ml量瓶中，取5ml于同一25ml量瓶中，加甲醇制成混合对照品液。

2.3 供试品溶液的制备 取兴仁金线莲药材粉末2.5g，精密称定，精密加入5%盐酸乙醇溶液50ml，称定重量，水浴回流4h，取出，放冷，用乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液即得。

2.4 精密度试验 取“2.3”项下制备的S4供试品溶液，连续进样6次，记录指纹图谱，以槲皮素、山柰素和异鼠李素为参照峰，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%。表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性考察 取“2.3”项下制备的S4供试品溶液，分别于0、8、16、24、32、48h进样分析，记录指纹图谱，以槲皮素、山柰素和异鼠李素为参照峰，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，表明供试品溶液在48h内稳定。

2.6 重复性试验 精密称取同一批兴仁金线莲粉末（S4）5份，按“2.3”项操作，制备5份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录指纹图谱，以槲皮素、山柰素和异鼠李素为参照峰，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.7 指纹图谱建立与分析

2.7.1 对照试验 取“2.2”项下方法制备的混合对照品溶液10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

2.7.2 指纹图谱的建立 分别称取12个批次的兴仁金线莲粉末，按“2.3”项操作，平行制备供试品溶液，取供试品溶液按“2.1”项方法进行分析，记录图谱。对保留时间8～80min的色谱峰进行分析，均有20个稳定的特征峰，确定其为共有指纹峰，S4的HPLC图谱见图2，12批兴仁金线莲HPLC指纹图谱共有模式图及对照图谱见图3。

2.7.3 共有峰相对保留时间和相对峰面积的测定 在前期研究的基础上[1]，选定含量较稳定、重复性好的槲皮素、山柰素和异鼠李素等作为参照峰，计算各峰的保留时间和相对峰面积，结果见表1。

2.7.4 指纹图谱相似度计算 采用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件，将12批次兴仁金线莲指纹图谱导入，以S4号作为相似度计算时校正的参照图谱，以平均数法生成参照图谱。由于采用梯度洗脱的方式及实验中不可避免因素的影响，各批次供试品指纹图谱中色谱峰保留时间产生一定迁移，因而不采用自动校正的方式，而是通过多点校正法对色谱峰保留时间进行校正，选择包含槲皮素、山柰素和异鼠李素在内的共20个共有峰作为校正的Mark峰，最终生成12批次兴仁金线莲的指纹图谱。计算各批次兴仁金线莲相似度，表明有较高的相似性，见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 实验采用二级管阵列检测器，考察槲皮素、山柰素和异鼠李素3个化合物以及供试品液的指纹图谱，最佳吸收波长在250～380nm范围，比较它们的最佳吸收波长下的指纹色谱峰。结果表明：在327nm下检测得到的特征峰最多，各个峰的分离度较好，且基线平稳，因此确定327nm作为兴仁金线莲指纹图谱的检测波长。

3.2 流动相的选择 参考了甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）[2]和乙腈-0.03%磷酸水溶液（24∶76）[3]，进行等度洗脱，色谱峰分不开，且特征峰少，经反复试验，最终确定用乙腈-0.4%磷酸水溶液作为流动相，进行梯度洗脱，供试品三成份峰能与其它峰得以分离，特征峰多且峰形较好。

3.3 HPLC条件优化 设定不同的洗脱梯度，根据其洗脱梯度下的色谱峰的峰形及分离度，最终确定最佳洗脱梯度，即流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0→5→10→30→45→70→80→85min，乙腈（A）对应的浓度梯度5%→10%→20%→25%→30%→40%→5%→5%。该方法简单、准确、重现性好。

3.4 指标性成份的选择 根据福建金线莲化学成份研究，结果表明该植物中富含黄酮类化合物，结构以槲皮素、山柰素和异鼠李素型黄酮醇苷为主[4-6]，具有较好的药理作用。前期研究中，兴仁金线莲中这三种成分含量较高，且稳定[7]，在建立的指纹图谱中都有很好的显示，故选作指标性成分。

3.5 指纹图谱相似度评价 实验采用HPLC法，通过DAD检测法确定了指纹图谱的检测波长，以兴仁金线莲的有效成份槲皮素、山柰素和异鼠李素为指标性成分而建立指纹图谱，确定了20个共有峰。兴仁金线莲相似度评价结果表明，12批供试品的HPLC指纹图谱相似度较高，10批处于0.9以上，同时也具有一定的差异。S5和S8号样品的相似度较低，在0.85以上，且各共有峰保留时间稳定，符合中药指纹图谱的技术要求。说明本实验的方法所建立的指纹图谱精密度高，重复性好，稳定性可靠，可以作为控制兴仁金线莲质量的依据之一。

综述，本文采用高效液相色谱法，建立了兴仁金线莲的指纹图谱，标定了20个共有指纹特征峰，指认了其中的三个成分，为兴仁金线莲质量控制提供了依据。

参考文献

[1]金效华，吉占和，覃海宁，等.贵州兰科植物增补[J].植物分类学报，2002，40（1）：82-88.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：296.

[3]关璟，王春兰，郭顺星，等.高效液相色谱法测定金线莲中黄酮含量[J].药物分析杂志，2008，28（1）：9-11.

[4]何春年，王春兰，郭顺星，等.福建金线莲的化学成分研究[J].中国药学杂志，2005（8）：761-763.

[5]何春年，王春兰，郭顺星，等.福建金线莲的化学成分研究Ⅱ[J].中国中药杂志，2005（10）：259-262.

[6] 关璟，王春兰，郭顺星.福建产金线莲黄酮苷类化学成分研究[J].中草药，2005，36（10）：1450.

[7]隆林.高效液相色谱法测定兴仁金线莲中黄酮的含量[J].医药卫生，2015（2）：86-87.

（收稿日期：2015.12.26）