牟天易 综述，简华刚 审校

(重庆医科大学附属第二医院急诊外科　400010)



·综述·

生物膜致慢性创面难以愈合的病理机制及其治疗*

牟天易 综述，简华刚△审校

(重庆医科大学附属第二医院急诊外科400010)

生物膜；伤口愈合；慢性创面；病理机制

慢性创面(chronic wounds)是指机体正常皮肤及组织损伤后，因内外因素作用，接受超过1个月的正规治疗，而无法经过及时、有序、正常的修复程序，达到解剖及功能上完整、无愈合倾向的创面[1-2]。临床上常见慢性创面有糖尿病足溃疡、创伤性溃疡、压力性溃疡、下肢静脉溃疡等。由于缺血缺氧、高血糖、失神经等情况，慢性创面中具有先天免疫功能的表皮受损，皮下组织外露，具有湿润环境，丰富营养，为细菌生物膜的形成提供理想环境。近年来，细菌生物膜的形成在慢性创面中所起的作用逐渐被重视，现代研究认为，除了缺氧、缺血再灌注损伤和宿主内在因素外,细菌生物膜的形成成为慢性创面难以愈合的主要障碍[3]。更加深入地了解细菌生物膜致慢性创面难愈合的机制及如何控制慢性化的恶性循环，将为慢性创面的治疗提供方法。本文就生物膜定义、生物膜致慢性创面难以愈合的病理机制、生物膜的临床治疗作简要综述。

1　生物膜的定义及生物膜存在于慢性创面

生物膜为微生物黏附于物体及活性组织表面或彼此黏附，包被于自身分泌的由蛋白质、DNA、多糖等组成的细胞外基质(extracelluar polymeric substance，EPS)，形成一个与其浮游状态完全不同的生长方式的群落，对宿主免疫系统及抗菌药物治疗形成天然抵抗，产生持续致病性的微生物聚集体[4]。生物膜是微生物针对不利环境形成的一种保护性生长方式。James等[5]调查生物膜的存在时发现，只有6%的急性创面发现生物膜，而60%的慢性创面中表现出生物膜的存在；这表明生物膜更多存在于慢性创面，而很少在急性创面，这可能与慢性创面难以愈合有关。创面生物膜的形成可能是创面慢性化的重要原因之一[3]；由于生物膜形成是细菌耐药的机制之一[6]，慢性创面中细菌生物膜的形成可能与临床上细菌多重耐药有关；慢性创面中生物膜作为细菌的储存库，源源不断地释放出浮游细菌，持续刺激机体产生炎性反应，让创面停滞于炎性反应期，生物膜在延迟慢性创面愈合中起着重要作用[7-8]。

2　生物膜致慢性创面难以愈合的病理机制

急性创面愈合经过凝结，炎性反应期，增生性阶段(肉芽组织形成)及再上皮化或重塑阶段，重建皮肤结构及功能的完整性；由于细菌生物膜不当的调节创面炎症细胞、实质细胞、炎症因子、细胞因子及pH值等，使慢性创面固定于炎性反应期，无法成功地进入增生性阶段及再上皮化或重塑阶段；由于生物膜的结构特点，形成一个致密物理屏障，对抗菌药物及免疫系统耐受，细菌生物膜难以被清除，持续存在于慢性创面，引起慢性创面出现持续低效应炎性反应。

2.1炎症细胞慢性创面中生物膜的持续存在，生物膜内的细菌及其分泌的细胞外基质作为趋化因子，源源不断地趋化和招募炎症细胞至创面。在创面发生时，中性粒细胞是到达创面第一批炎症细胞,通过消除细菌、异物、坏死组织,并释放细胞因子促进血管再生和肉芽组织的形成，有助于伤口愈合。然而,由于细菌生物膜致密的细胞外基质，中性粒细胞难以大量渗透到生物膜内部，即使部分渗透到生物膜周围，也难以对其发挥吞噬作用。在群体感应系统作用下，各种细菌毒力因子的产生，抑制了中性粒细胞的活性；有报道称铜绿假单胞菌生物膜的群体感应系统控制的毒力因子——鼠李糖脂,能引起中性粒细胞快速溶解[9]，致使生物膜难以被清除；中性粒细胞在感染部位持续的聚集，产生大量的溶细胞酶、活性氧、蛋白酶(弹性蛋白酶和金属蛋白酶)。而低水平的活性氧作为胞内信号的重要介质可有效地促使创面愈合；不受控的活性氧释放，导致细胞组件如磷脂、蛋白质、细胞质酶和核酸等破坏，使创面周围正常细胞发生坏死及凋亡[10]。蛋白酶降解参与伤口愈合级联的关键蛋白质和细胞外基质及生长因子，对邻近的健康组织造成伤害，从而抑制创面愈合。

2.2实质细胞角质细胞及成纤维细胞是创面愈合的主要细胞，但在慢性创面中细菌生物膜致角质细胞及成纤维细胞失活，并加速其凋亡。Secor等[11]在金黄色葡萄球菌生物膜及其浮游状态对人类角质细胞影响的实验中发现，以暴露于金黄色葡萄球浮游菌的角质细胞为对照，暴露于生物膜的角质细胞发生快速凋亡在4 h及24 h，并在24 h后相互黏附的细胞数目显著下降；在4 h时暴露于生物膜基质的角质细胞产生更多的细胞因子，但在24 h后，除肿瘤坏死因子α(TNF-α)外，其角质细胞产生细胞因子显著减少，这可能与生物膜抑制角质细胞活性并加速其凋亡有关。Kirker等[12]在研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的浮游菌和生物膜对人类成纤维细胞的影响时发现：在48 h后，成纤维细胞的细胞活性明显降低，且黏附于培养皿的细胞数目显著减少。

2.3炎症因子及细胞因子细菌生物膜存在的慢性创面有异常的炎症因子、生长因子的表达，可能延迟创面的愈合。Kirker等[12]检测MRSA的浮游菌和生物膜对人类成纤维细胞相关细胞因子水平的影响发现，生物膜组IL-6、IL-8水平显著减少，但生物膜组的细胞产生TNF-α水平明显增加。IL-6可刺激成纤维细胞生长因子产生，同时增加中性粒细胞黏附于成纤维细胞，从而促进创面愈合；IL-8作为一个强有力的血管生成因子，在促进角质细胞的迁移和血管再生方面发挥着重要作用，TNF-α能够诱导许多细胞凋亡，可能加速创面愈合的实质细胞凋亡，而延迟创面愈合。Guggenheim等[13]在体外生物膜实验中发现细胞因子被生物膜降解，通过对生物膜的蛋白质组学分析，生物膜中的蛋白酶可能与细胞因子的降解有关。Kirker等[12]检测了人类角质细胞代表性生长因子[血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)]和肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)，暴露于生物膜的细胞产生的生长因子(VEGF、TGF-β1和HB-EGF)水平明显降低，生长因子将促进角质细胞和成纤维细胞进行有丝分裂，这表明促进创面愈合的生长因子减少，可能与生物膜存在的慢性创面难以愈合有关。

2.4创面pH值细胞内外的pH值是创面愈合另一重要因素，且不同的治疗阶段需要不同pH值范围。创面愈合依赖于细胞内外pH值,其变化将影响血管生成、胶原蛋白的形成、中性粒细胞及巨噬细胞功能、抗菌药物活性。正常皮肤的pH值范围在4.0～6.0，皮肤表面有酸性外膜，这对皮肤功能和抑制微生物致病是至关重要的，低的pH(pH=5.0)抑制微生物生长[14]，已被证实正常创面的愈合发生在低pH值环境下，而慢性创面通常被检测为碱性环境。酸化的创面床已经发现有助于创面感染的控制,而碱性环境则减慢创面愈合的进程。有研究表明慢性创面pH值范围从6.5～8.5(平均在7.4)[15]，增加pH值将增加的生物膜的产生[16]，碱性化的环境可能是由坏死组织、细菌及其产物氨造成,碱性环境的形成将进一步促进细菌增殖。生物膜存在的慢性创面，有持续的炎性反应，致中性粒细胞在创面聚集，中性粒细胞释放过多弹性蛋白酶及金属蛋白酶，碱性环境增加基质金属蛋白酶和中性粒细胞的弹性蛋白酶活性，增加正常组织和细胞因子的破坏，从而损伤创面的愈合；酸性的环境抑制中性粒细胞过度释放蛋白酶和其破坏性的影响，将有利于慢性创面。大多数抗菌剂表现为pH依赖的抗菌活性，聚维酮碘在低pH时抗菌活性增强，而在高pH时抗菌活性明显减弱[14]。直接或间接降低创面pH值的敷料有助于防止感染和可能更利于快速愈合。pH值降低,标准氧合血红蛋白解离曲线向右移动，氧合血红蛋白释放更多的氧气，从而改善创面愈合[17]。

3　生物膜的临床治疗措施

3.1清创术在慢性创面中，创面清创术主要是清除创面分泌物、坏死组织、生物膜，减少细菌在创面的负荷量，并促进中性粒细胞和巨噬细胞趋化到创面,从而有利于清除残留于创面的细菌[18]。清创术是去除和破坏生物膜最有效的方式[19]；但在清创后菌落计数分析揭示细菌负荷量的降低是短时间的，在清创后48 h内，细菌负荷量几乎恢复到初始水平,表明清创术只能短暂消除生物膜感染，如何防止清创后生物膜的再形成，需要其他治疗的协助；在清除创面床深部的细菌生物膜时，要警惕清创术可能导致深层组织的感染[20]。

3.2抗菌药物慢性创面中细菌生物膜难以清除的另一个原因是细菌生物膜对全身和局部抗菌药物的耐药。有研究表明，生物膜细菌耐受抗菌药物浓度比其浮游状态下高10～1 000倍[6,21]。生物膜的生长分黏附期、种植期、生长期、成熟期、播散期。在黏附期及播散期的浮游细菌，对各种抗菌药物相对比较敏感，及时应用敏感、足量抗菌药物可阻止或破坏生物膜的形成。Wolcott等[22]在研究新形成的细菌生物膜对抗菌药物敏感性实验中发现，在抗菌药物治疗的第一个24 h内生物膜对其敏感，48 h后生物膜变得越来越耐受，可能是早期生物膜未发育成熟，其致密的结构未完全形成，抗菌药物能有效的渗透到生物膜的内部发挥杀菌作用，随着时间推移，生物膜发育成熟，由于渗透限制，导致抗菌药物在生物膜内达不到有效杀菌浓度。播散期及清创后生物膜释放出来的浮游细菌，常常是造成临床上常见的慢性感染急性发作及形成新的生物膜的重要原因，全身及局部使用抗菌药物能够抑制或杀灭生物膜释放出的浮游细菌，从而控制慢性感染急性发作及新生物膜的形成。

3.3银离子含银离子抗菌剂是目前临床治疗慢性创面生物膜较为常用的敷料，其疗效得到肯定。Valente等[18]在体外创面模型中，单独使用银离子敷料治疗3 d，银离子敷料覆盖的金黄色葡萄球菌生物膜的细菌数量被降低超过100 000倍；使用银离子敷料5 d减少了生物膜大多数细菌数量，表明银离子敷料可抑制细菌生物膜的发展，认为活性银离子能够对细菌的细胞壁的许多结构组件和生化途径产生毒性作用。Percival等[23]调查含银离子创面敷料在铜绿假单胞菌、肠杆菌属及金黄色葡萄球菌生物膜的疗效时，发现生物膜暴露于银离子敷料48 h后,生物膜内的细菌被全部杀死。Bjarnsholt等[24]研究银离子对铜绿假单胞菌生物膜的疗效时，发现5～10 mg/mL浓度磺胺嘧啶银盐能根除生物膜,但1 mg/mL的浓度没有杀灭的效果。

3.4负压封闭引流治疗负压封闭引流治疗在治疗慢性难愈合创面的作用逐渐得到共识，其主要机制是保持创面生理湿润的愈合环境，减少细菌负荷，增加局部血流量和促进肉芽组织的形成。Valente等[18]在慢性创面的体外实验中，联合局部银离子敷料和负压封闭引流治疗对生物膜的影响研究中发现，负压封闭引流治疗引起生物膜结构性变化,生物膜中结构性改变涉及到其对银离子敏感性增加,同时应用银离子敷料和负压封闭引流治疗生物膜的感染，生物膜中细菌数量显著降低，银离子敷料和负压封闭引流治疗联合治疗生物膜比单独使用银离子敷料抑制至少强10倍，证实负压封闭引流治疗与银离子对治疗生物膜有协同效果。

4　展　　望

随着肥胖、慢性疾病、老龄人口的增加，慢性创面在临床中患病率将越来越高。细菌生物膜对慢性创面炎症细胞、实质细胞、炎症因子、细胞因子及pH值造成不利影响，使创面出现持续低效应炎性反应，且停滞在炎性反应期，未能成功地进入增生性阶段及再上皮化或重塑阶段，从而导致创面延迟愈合。细菌生物膜作为慢性创面难以愈合的主要障碍之一，积极阻止生物膜的形成将有助于控制创面慢性化，有效清除生物膜将是未来治疗慢性创面研究的热点，如何阻断生物膜引起慢性创面持续低效应的炎性反应，将可能有助于创面的愈合。

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牟天易(1987-)，在读硕士，主要从事慢性创面研究。△

，E-mail:hgjian@sohu.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.043

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1671-8348(2016)07-0988-03

2015-09-02

2015-11-15)