米慧娟，王永香，张庆芬，吴 云，王振中，萧 伟＊＊

（1. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；

2. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

江西省樟树县GAP基地不同采收时间栀子药材的质量研究＊

米慧娟1，2，王永香1，2，张庆芬1，2，吴 云1，2，王振中1，2，萧 伟1，2＊＊

（1. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；

2. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

目的：研究江西省樟树县 GAP 基地不同采收时间栀子药材中栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷 I、京尼平苷酸、绿原酸、隐绿原酸 6 种主要药效成分含量及液相指纹图谱相似度的变化规律，为江西省樟树县 GAP 基地栀子药材最佳采收期的确定提供理论依据。方法：以栀子药材 6 种主要药效成分含量及液相指纹图谱相似度为指标，考察 9 个不同采收时间栀子药材质量。结果：不同采收时间的栀子药材质量有明显差异。结论：江西省樟树县 GAP 基地的栀子药材的最佳采收时间为 10 月中旬至 11 月中旬，果实呈红黄色。

樟树县药材 GAP 基地 栀子 液相指纹图谱 质量

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒等作用，主要治疗热病心烦，湿热黄疸，淋证涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡，外治扭挫伤痛[1，2]，为常用的中药材。伴随中药“国际化”的潮流，2003 年9月国家药品监督管理局制订了中国中药材生产质量管理规范（GAP），对中药材生产的基地选定、品种栽培、采收加工、质量标准等做出了相应规定[3，4]。江西省樟树县的药材种植源远流长，总面积18 万亩，千亩以上基地 18 个，品种以“三子一壳”（栀子、吴茱子、车前子、枳壳）为主，形成江西道地中药材主产区[5-7]。栀子药材生产基地通过了国家 GAP认证，2013 年栀子种植面积已达 11.5 万亩，约占全国产量的 83%，产值近 10 亿元。

现代药理研究表明，栀子具有抗炎、镇静、镇痛、保肝利胆、抗凝血、抗氧化等作用[8-13]，环烯醚萜类和二萜色素类化合物是栀子的主要成分，也是其主要生物活性成分[14，15]。为了确定樟树县 GAP 基地栀子药材的最佳采收时间，本文以栀子药材高效液相指纹图谱中的栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷I、京尼平苷酸、绿原酸、隐绿原酸 6个主要药效成分为指标，考察江西省樟树县 GAP 基地栀子药材不同采收时间的质量变化规律，确定栀子药材最佳采收期，为栀子最佳采收时间的确定提供理论依据。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪 Agilent 1100（美国安捷伦公司）；DAD 检测器（美国安捷伦公司）；LK-200A 100 g 手提式高速中药粉碎机（浙江温岭市创立药材仪器厂），电子天平（Sartorius公司）；KQ-250B 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9145A 9000 系电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110749-200512）；京尼平龙胆双糖苷（成都曼斯特公司，批号：MUST-111120，纯度≥98%）；西红花苷 I （中国食品药品检定研究院，批号：110588-200102）；京尼平苷酸（中国食品药品检定研究院，批号：111828-200903 )；绿原酸（中国食品药品检定研究院，批号：110753-200914）；隐绿原酸（美国Sigma公司，批号：101245643，纯度≥98%）；磷酸（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120703），甲醇、乙腈为色谱纯（Tedia Company），水为重蒸馏水。

本研究中的栀子药材均经康济大药房吴舟中药执业药师鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 栀子药材采收时间分布

2010版一部《中国药典》对栀子采收期描述为“9-11月果实成熟呈红黄色时采收”，结合药典要求及传统采收经验，本实验在江西省樟树县栀子药材GAP 基地同一地块自2012 年9月10日开始采摘，2012 年11月30日采摘结束，每间隔10天采摘一次，每次采摘两份样品，每份样品平行检测两次。9个不同采收时间样品均采用相同干燥方法（60℃常压烘干）获得干燥样品。栀子药材的采收时间及干燥品色泽见表 1。

表1 栀子药材采收时间及药材干燥品性状

2.2 药效指标含量测定方法

含量测定指标有栀子苷、京尼平苷龙胆双糖苷、西红花苷I、京尼平苷酸、绿原酸、隐绿原酸。

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250 × 4.6 mm），流动相：乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），洗脱梯度：0-10 min，5%-10%（A）；10-20 min，10%-18%（A）；20-30min，18%-20% ( A )；30 -40 min，20%-45% ( A )；40-50 min，45%-5% ( A )。流速：1 mL / min，柱温：30℃，DAD 检测器的检测波长：238 nm、324 nm、440 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称量栀子苷 14.012 mg、京尼平苷龙胆双糖苷 2.502 mg、西红花苷I 0.045 mg、京尼平苷酸 0.160 mg、绿原酸 0.410 mg、隐绿原酸 0.097 mg，置 25 mL 容量瓶中，加50% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后及得质量浓度分别为 560.48、100.08、1.80、6.40、16.40、3.88 μg·mL-1混合对照品溶液。见图1。

2.2.3 供试品溶液的制备

取栀子粉末（过60目筛）0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，称定重量，超声处理40 min，放冷，补足失重，摇匀，过滤。取续滤液1 mL于5 mL的容量瓶中，用50%甲醇稀释、定容至刻度，12 000 rpm 离心，取上清液，即得供试品溶液。见图2。

2.2.4 方法学考察

（1）线性关系考察

分别精密称取栀子苷 50 mg、京尼平苷龙胆双糖苷 5 mg、西红花苷I 0.05 mg、京尼平苷酸 1 mg、绿原酸 1 mg、隐绿原酸 0.1 mg，置 25 mL 量瓶中，加 50% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。对混合对照品进行 0、2.5、5、10、20、40 倍稀释，分别精密吸取上述对照品溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。以对照品质量浓度（mg·L-1）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。栀子苷回归方程 Y=4.521 X-8.715，r=0.999，线性范围50-2 000 μg·L-1；京尼平苷龙胆双糖苷Y=3.987X-3.451，r=0.999 9，线性范围5-200 μg·L-1；西红花苷 I 回归方程 Y = 5.460 X - 4.651，r = 1，线性范围 0.05-2 μg·L-1；京尼平苷酸回归方程Y=3.190X-7.623，r = 1，线性范围-40 μg·L-1；绿原酸回归方程 Y＝7.512 X-6.132， r = 0.999 9，线性范围 1-40 μg·L-1；隐绿原酸回归方程Y=4.765X-2.75，r=0.999 9，线性范围0.1-4.0 μg·L-1。

图1 混合对照品高效液相色谱图

（2）精密度实验

取上述线性关系考察的混合对照品溶液（栀子苷56.048 μg·mL-1、京尼平苷龙胆双糖苷10.008 μg·mL-1、西红花苷I 0.18 μg·mL-1、京尼平苷酸0.64 μg·mL-1、绿原酸1.64 μg·mL-1、隐绿原酸 0.388 μg·mL-1），按“2.2.2”项下色谱条件，重复进样6次，测定栀子苷、京尼平苷龙胆双糖苷、西红花苷I、京尼平苷酸、绿原酸、隐绿原酸的峰面积，测定各物质峰面积的RSD值分别为0.28%、0.57%、0.83%、0.43%、0.57%和0.54%。结果表明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。

（3）重复性考察

取同一批栀子药材（120910），按上述色谱方法平行制备供试品溶液6份，分别测定栀子苷、京尼平苷龙胆双糖苷、西红花苷I、京尼平苷酸、绿原酸、隐绿原酸6种物质含量，各物质含量测定结果的RSD值分别为0.85%、0.93%、1.21%、0.87%、1.04%、1.63%和1.47%。结果表明，该法重复性良好。

（4）稳定性考察

取同一供试品溶液，分别放置0、4、8、12、16、24 h，按上述色谱方法测定供试品中栀子苷、京尼平苷龙胆双糖苷、西红花苷I、京尼平苷酸、绿原酸、隐绿原酸的峰面积，计算各物质的RSD值分别为0.25%、0.35%、0.75%、1.04%、0.84%和0.83%。结果显示，供试品溶液在24 h内稳定。

图2 混合对照和样品HPLC色谱图

（5）加样回收率考察

取120910批栀子药材（栀子苷38.03 mg·g-1、京尼平苷龙胆双糖苷8.87 mg·g-1、西红花苷I 0.34 mg·g-1、京尼平苷酸0.64 mg·g-1、绿原酸1.72 mg·g-1、隐绿原酸0.35 mg·g-1）6份，精密称定，分别精密加入精密度考察项下的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下制备供试品溶液，按上述色谱方法进样测定，计算回收率，结果分别为99.1%、99.6%、99.4%、101.4%、100.3%和98.7%。结果表明，该法回收率良好。

该色谱方法经过精密度、重复性、稳定性、加样回收率试验，结果显示该方法稳定可重复，可用于栀子药材指纹图谱的测定。

2.3 栀子药材指纹图谱测定方法

2.3.1 色谱条件

Agilent 1100 液相色谱仪，色谱柱：Phenomenex luna C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）- 0.1%磷酸水溶液（B），洗脱程序为：0-50 min，20%-60%（A）；50-60min，60%（A）。流速： 0.8 mL·min-1；检测波长：225 nm。分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪，测定。按参照物栀子苷的峰面积计算，理论板数不低于6 000。

参照物溶液的制备：取栀子苷对照品，精密称定，加甲醇制成每 1 mL含 50 mg的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备

取栀子药材，粉碎（过60目筛），取细粉约 0.1 g，精密称定，置 50 mL 锥形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，超声 40 min，过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 方法学考察

（1）精密度考察

取120901批栀子粉末，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，同一供试品溶液连续进样6次，结果各相对保留时间的RSD值小于3%，相对峰面积的RSD值小于3%。结果表明，该方法精密度良好。

（2）重复性考察

取同一批栀子粉末5份，精密称定，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进样检测，结果各相对保留时间的RSD值小于3%，相对峰面积的RSD值小于3%。结果表明，该方法重复性良好。

（3）稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h进样检测，结果各相对保留时间小于3%，相对峰面积小于3%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 栀子药材标准指纹图谱

取江西省樟树县、新干县、泰和县、永丰县市售栀子药材各 5 个样本，共 20 个样本构建栀子药材标准指纹图谱。用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价软件，根据《中药指纹图谱研究的技术要求》，将 20 批次栀子图谱数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件A版》，匹配后图谱如图 3。

以这 20 批供试品指纹图谱为基础获得含有 5个 共有峰的“共有模式指纹图谱”作为标准指纹图谱，标准指纹图谱如图 4。

2.5 实验结果

按照“2.2”、“2.3”项下多成分含量测定及液相指纹图谱方法，测定表 1 中不同采收时间栀子样本中栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷 I、京尼平苷酸、绿原酸、隐绿原酸的含量及液相指纹相似度，每个时间段分别采收两个样本，每个样本取两份平行样进行检测。本文以各检测指标为观测变量，采收时间段为控制变量，使用IBM SPSS 20.0 统计分析软件进行单因素方差分析，判断不同采收时间段各观测指标检测值是否存在显著性差异。各观测指标均值见表2，方差分析结果见表3，由方差分析结果可以看出，采收时间对栀子药材中京尼平苷酸含量无显著影响，对栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷 I、绿原酸、隐绿原酸和指纹图谱相似度具有显著影响。

2.5 实验结果聚类分析

图3 栀子药材液相指纹匹配后图谱

图4 栀子药材对照指纹图谱 ( 225 nm )

表2 不同采收时间段栀子药材中6种药效成分含量均值/mg·g-1

表3 7个指标单因素方差分析结果

将栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷 I、绿原酸、隐绿原酸、液相指纹相似度共6个结果数据输入 SPSS 20.0，使用组间联接聚类方法，距离的计算方法选择Euclidean distance，因参与聚类分析的变量存在数量级上的差异，消除数量级差的方法选择全距从 0 到 1 进行系统聚类分析，分析结果见图5。120910、120920、120930、121130 聚为一类，此类采收期为 9 月份及 11 月底，9 月栀子果实从色泽上看还是青灰色，果实未完全成熟，栀子苷、绿原酸、液相指纹图谱相似度均较低，121130 为 11 月30 日采收的样本外观观察为熟过的果实，各成分指标均有所降低。121010、121020、121030、121110、11120 聚为一类，此类样品色泽为黄色或红黄色，此时主要含测指标和液相指纹相似度均达到最高值。聚类结果显示，10 月到 11 月中旬为樟树县 GAP 基地最佳采收时间。

3 讨论

栀子药材为常用的中药材之一，已有2 000多年的应用历史。2010 版中国药典一部栀子项下描述其采收时间为“9-11月果实成熟呈红黄色时采收”采收时间范围为 2 个月时间，由于栀子各主要产区地理气候均不相同，为了确定江西樟树县栀子GAP 基地栀子药材最佳采收时间，本文根据 9 个不同采收时间栀子药材中 6 个药效成分含量及液相指纹图谱相似度，使用 SPSS 20.0 软件中聚类分析方法，确定江西樟树县栀子 GAP 基地栀子药材最佳采收时间。实验结果表明栀子药材不同采收时间栀子苷、京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷、绿原酸、隐绿原酸、西红花苷 I 的含量值及液相指纹相似度均有明显变化，各指标含量稳定且处于高峰值的时间范围为 10 月 10 日 到 11 月 20 日。

图 5 不同采收时间栀子样本聚类分析图

本文在药典规定的栀子采收时间范围内进一步确定了江西樟树县GAP 基地的栀子药材的最佳采收时间，为基地栀子药材采收时间的确定提供了理论依据。

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Gardenia Quality Research within Different Harvesting Periods in the GAP Base in Zhangshu County of Jiangxi Province

Mi Huijuan1,2, Wang Yongxiang1,2, Zhang Qingfen1,2, Wu Yun1,2, Wang Zhenzhong1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study aimed to determine the best harvest time of gardenias in the GAP base in Zhangshu County, Jiangxi Province of China. Similarities of HPLC fingerprints and the contents of six activity ingredients, including geniposide, genipin 1-gentiobioside, crocin I, geniposidic acid, chlorogenic acid and 4-dicaffeoylquinic acid, were detected from various gardenias of nine separated harvest periods. The contents and similarities of HPLC fingerprints of gardenias were the main indexes. As a result, the nine kinds of gardenias presented different qualities. In conclusion, period from mid-October to mid-November was the best time for gardenia harvest, as the fruit presenting red and yellow.

GAP base of Zhangshu County, gardenia, HPLC fingerprint, quality

10.11842/wst.2016.08.025

R283.6

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2015-04-02

修回日期：2015-04-04

＊ 科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09402203）：现代中药创新集群与数字制药技术平台，负责人：王振中。

＊＊ 通讯作者：萧伟，本刊编委，博士，研究员级高级工程师，主要研究方向：中药制剂和创新中药的研究与开发。