迟森森，王 翀，刘 斌

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

基于绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷提取率的四妙勇安汤拆方分析＊

迟森森，王 翀，刘 斌＊＊

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

目的：研究四妙勇安汤不同配伍组合对绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷提取率的影响。方法：将四妙勇安汤拆方后，采用高效液相色谱法，SunFireTM C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，测定绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的含量并分别计算其提取率。结果：测定了原方及拆方后共14组样品中绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的含量并计算相应提取率，其回归方程分别为Y=2 945 611.51X-77 211.93（r=0.999 6），Y=5 266 108.02X-2 733.36（r=0.999 6），Y=8 599 526.24X-11 646.29（r=0.999 6）和Y=2 822 342.06X-1 685.64（r=0.999 8），线性范围分别为0.237-1.422，0.009 76-0.058 56，0.015 68-0.094 08和0.007 27-0.043 6 μg，平均加样回收率分别为99.39%（RSD=1.76%），102.59%（RSD=2.55%），103.60%（RSD=1.07%）和99.32%（RSD=2.93%）。结论：与单味金银花、当归相比，拆方组绿原酸和阿魏酸的提取率均有明显降低，而其全方配伍后的提取率仅低于单味药单煎时提取率；玄参中肉桂酸和哈巴俄苷在全方配伍后提取率最高。本研究有助于揭示四妙勇安汤单味药配伍过程中化学组分变化及配伍作用机制。

四妙勇安汤 拆方配伍 绿原酸 阿魏酸 肉桂酸 哈巴俄苷

中药复方是中医临床用药的主要形式，在理、法、方、药中占有重要的一环。复方中各组方药味通过“君臣佐使”配伍，从而使群药形成有制之师，针对证或病，达到整体调节的目的[1]。中药复方四妙勇安汤最早见于华佗的《神医秘传》[2]，后被收载于《验方新编》，该方由金银花、玄参、当归和甘草四味药组成，具有滋阴降火、活血化瘀、和营解毒之功效，临床常用于治疗脱疽[3-5]、血栓闭塞性脉管炎[6]、结节性红斑和痛风性关节炎[7]等疾病。化学成分研究表明：该方中的四味药含有有机酸、黄酮、环烯醚萜、苯丙素、挥发油、三萜皂苷和多糖等成分[8-11]。由于该方的化学成分包含有机酸，水煎液呈酸性，可能影响有效成分的溶出率及其存在状态，或使酸不稳定成分发生化学变化。前期研究发现：四妙勇安汤中金银花与玄参、当归和甘草不同配伍均能提高当药苷和马钱苷的提取率[12]；玄参与金银花、当归、甘草配伍均能降低哈巴苷的提取率，但全方煎煮可提高其提取率[13]；甘草与金银花、玄参、当归配伍均能明显降低甘草酸的提取率[14]。本文以四妙勇安汤中3种有机酸类成分绿原酸、阿魏酸和肉桂酸，1种环烯醚萜苷类成分哈巴俄苷为指标，研究拆方配伍对以上4个成分提取率的影响，为全面系统探究四妙勇安汤单味药配伍过程中化学组分变化及配伍作用机制提供依据。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，自带1525型二元高压梯度泵系统，2414型柱温控制系统，2998型PDA检测器，2707型自动进样系统（美国Waters公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Sartorious BT 25S型1/100 000电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

表1 四妙勇安汤组方药味不同拆方组成

金银花（产地：山东，批号：140201）、玄参（产地：浙江，批号：140101）、当归（产地：甘肃，批号：140101）和甘草（产地：甘肃，批号：140301）药材均购自安国市鼎晟中药饮片经营有限公司。经北京中医药大学刘春生教授鉴定：所购金银花药材为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾；所购当归药材为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根；所购玄参药材为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根；所购甘草药材为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎。绿原酸（批号：110753-201314）、阿魏酸（批号：10773-201012）、肉桂酸（批号：110786-200503）和哈巴俄苷（批号：111730-201307）对照品均购于中国食品药品检定研究院。乙腈（德国Merck公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

SunfireTM C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；检测波长278 nm（肉桂酸和哈巴俄苷）、316 nm（绿原酸和阿魏酸）；柱温 35℃；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0-25 min，12% A；25-60 min，12%-30% A；60-75 min，30%-95% A；75-80 min，95%A）。

2.2 样品制备

参照《验方新编》，以金银花∶玄参∶当归∶甘草=3∶3∶2∶1的比例，按表1所示，称取四妙勇安汤组方单味药14个拆方组饮片。取各组饮片，分别加入12倍体积的水浸泡60 min后，回流提取60 min，滤过，药渣加10倍量水回流提取45 min，合并两次滤液，回收溶剂至0.5 g·mL-1，用95%乙醇调节乙醇质量分数至70%，静置过夜，离心取上清液，减压回收溶剂，残留物减压干燥得干膏，称重，备用。

2.3 对照品溶液制备

分别精密称取绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷对照品适量，加50%甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.119、0.004 88、0.007 84和0.003 67 mg·mL-1的对照品溶液。

2.4 供试品溶液制备

各取四妙勇安汤不同拆方组水提物约50 mg，精密称定于10 mL量瓶中，加50%甲醇超声溶解（100 kHz，30 min），放冷，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.5 阴性样品溶液制备

分别取四妙勇安汤不同拆方组中缺金银花组、缺玄参组和缺当归组样品，按照“2.2”和“2.4”项下方法，制备金银花、玄参和当归阴性样品溶液。

2.6 空白试验

按照“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷对照品溶液各10 μL、供试品溶液及缺金银花、缺玄参、缺当归阴性样品溶液各25 μL进样检测。在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性样品溶液色谱图相应位置无色谱峰，结果见图1、图2和图3。

2.7 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液各2，4，6，8，10，12 μL进样检测，测定色谱峰峰面积。以对照品的进样量（X）为横坐标，色谱峰的峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。计算绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷回归方程分别为：Y=2 945 611.51X-77 211.93，r=0.999 6（n=5）；Y=5 266 108.02X-2 733.36，r=0.999 6（n=5）；Y=8 599 526.24X-11 646.29，r=0.999 6（n=5）和Y=2 822 342.06X- 1 685.64，r=0.999 8（n=5），表明绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷进样量分别在0.237-1.422，0.009 76-0.058 56，0.015 68-0.094 08和0.007 27-0.043 6 μg范围内线性关系良好。

2.8 精密度考察

称取样品1（全方）2份（约25 mg和50 mg），精密称定，按“2.4”项下方法处理，前者精密吸取25 μL（测定绿原酸），后者精密吸取50 μL（测定阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷），连续进样6次测定绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷色谱峰峰面积，计算RSD值分别为0.19%，1.79%，1.15%和0.72%（n=6），表明精密度良好。

2.9 稳定性考察

称取样品1（全方）2份（约25 mg和50 mg），精密称定，按“2.4”项下方法处理，前者精密吸取25 μL（测定绿原酸），后者精密吸取50 μL（测定阿魏酸、肉桂酸、哈巴俄苷），分别于制备后0，2，4，6，8，10，12 h进样，测定绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷色谱峰峰面积，计算RSD值分别为0.21%，2.93%，1.59%和2.01% ，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.10 重复性考察

称取样品1（全方）6份，每份分为2份（25 mg和50 mg），精密称定，按“2.4”项下方法处理，前者精密吸取25 μL（测定绿原酸），后者精密吸取50 μL（测定阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷）进样检测，测定色谱峰峰面积。计算绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的平均质量分数分别为1.704 5%（RSD = 0.85%），0.015 1%（RSD = 2.96%），0.028 0%（RSD = 2.63%）和0.013 1%（RSD = 1.14%），表明该方法重复性符合要求。

2.11 加样回收率试验

称取已知含量的样品1（全方）（绿原酸的平均含量为1.704 5%）6份，每份约12.5 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，精密加入绿原酸对照品溶液（0.395 mg·mL-1）0.5 mL，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，备用。

称取已知含量的样品1（全方）（阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的平均含量分别为0.015 1%、0.028 0%和0.013 1%）6份，每份约25 mg，精密称定于10 mL量瓶中，分别精密加入阿魏酸对照品溶液（0.012 2mg·mL-1）0.3 mL，肉桂酸对照品溶液（0.007 84 mg·mL-1）0.9 mL，哈巴俄苷对照品溶液（0.012 12 mg·mL-1）0.27 mL，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，备用。

图1 绿原酸对照品、缺金银花阴性样品、供试品HPLC色谱图

图2 阿魏酸对照品、缺当归阴性样品、供试品HPLC色谱图

分别精密吸取以上两种供试品溶液25 μL和50 μL进样检测，测定各色谱峰峰面积，计算绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的含量和回收率，结果见表2。

2.12 样品含量测定

分别取四妙勇安汤不同拆方组样品各3份，每份分为2份（25 mg和50 mg），精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，前者精密吸取25 μL（测定绿原酸），后者精密吸取50 μL（测定阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷），精密吸取绿原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷混合对照品溶液8 μL进样检测，测定色谱峰峰面积，并计算其含量和提取率，结果见表3。

3 讨论

四妙勇安汤拆方含量测定结果表明，组方中四味药经不同配伍后，金银花水煎液中绿原酸、当归水煎液中阿魏酸的提取率均较单煎时明显降低，其最大降低值分别为34.55%和74.69%。玄参中哈巴俄苷在其配伍金银花后，提取率降低了5.83%，金银花、当归和玄参三味药配伍后，哈巴俄苷的提取率降低了5.03%，而其它5种配伍方式则均会增加哈巴俄苷提取率。三味药配伍方式均降低了绿原酸、肉桂酸和阿魏酸这3类有机酸类成分的提取率，其中玄参、当归和甘草配伍后有机酸类成分提取率最低。肉桂酸和哈巴俄苷在全方配伍后提取率最高，分别较单煎时增加了4.16%和10.65%，而绿原酸和阿魏酸在全方配伍后的提取率仅低于单味药单煎时提取率。

表2 加样回收率测定结果

在实验过程中，未发现不同配伍水煎液出现沉淀，有机酸类成分提取率均较单煎时降低的原因可能是有机酸类成分存在溶出竞争，提取被抑制[15]。绿原酸是方中君药金银花清热解毒的主要有效成分，其提取率在金银花单煎时最高，这符合四妙勇安汤使用时“初起用金银花二斤煎汤，方可解其毒”的用药规律，配伍后绿原酸提取率降低而清热解毒力不减也说明[16]该方清热解毒作用不单是绿原酸所为，而是四妙勇安汤各组成药物间、各有效成分间协同作用。哈巴俄苷和肉桂酸为君药玄参泻火解毒的主要成分之一[17，18]，其提取率在全方配伍后达到最高。阿魏酸为佐药当归活血散瘀的活性成分[19]，其对君药金银花中绿原酸的提取率有较大的影响。上述结果表明，在探讨四妙勇安汤药效物质基础及其配伍规律时，应充分考虑复方组方单味药之间相辅相成的整体性。但方剂配伍研究仅是阐明中药复方防治疾病的物质基础及其作用方式的有效途径之一，若要阐明四妙勇安汤更确切的药效物质基础及其相互作用机制，尚有待于多种途径的进一步研究。

续表2

表3 14个拆方组样品含量测定结果（%，n=3）

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Decomposition Analysis Method in the Extraction Rates of Chlorogenic Acid, Ferulic Acid, Cinnamic Acid and Harpagoside from Simiao Yong’an Decoction

Chi Sensen, Wang Chong, Liu Bin
(School of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to investigate the influences of different compatible combinations of Simiao Yong'an decoction (SYD) on the extraction rates of chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside, which were determined by HPLC with a SunFireTMC18analytical column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) in the dismantling of SYD. The mobile phase was composed of acetonitrile (A) and aqueousphosphoric acid (0.1%) (B) using a gradient elution. Extractions were performed at 35℃ with a flow rate of 1.0 mL·min-1. The chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside in fourteen groups from the original prescription and dismantlement were detected and analyzed. As a result, the regression formulations for chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside were Y = 2 945 611.51X-77 211.93 (r = 0.999 6), Y = 5 266 108.02X-2 733.36 (r = 0.999 6), Y = 8 599 526.24X-11 646.29(r = 0.999 6) and Y = 2 822 342.06X-1 685.64 (r = 0.999 8), respectively. Theindividual linearity of the extracts ranged from 0.237 to 1.422 μg, 0.009 76 to 0.058 56 μg, 0.015 68 to 0.094 08 μg and 0.007 27 to 0.043 6 μg, respectively. The average recoveries of chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside were 99.39% (RSD 1.76%), 102.59% (RSD 2.55%), 103.60% (RSD 1.07%) and 99.32% (RSD 2.93%). Compared with single LoniceraeJaponicae Flos and Angelica sinensis（Oliv.）Diels., the extraction rates of chlorogenic acid and ferulic acid were obviously reduced in the dismantlement of SYD. Those of the whole prescription were superior to the other groups’, while the extraction rates of cinnamic acid and harpagoside of Scrophularia ningpoensis Hemsl. were the highest in the whole prescription. In conclusion, this study may be beneficial to uncovering the material basis changes behind the compatible mechanisms of SYD.

Simiao Yong'an decoction, compatibility and dismantlement of prescriptions, chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid, harpagoside

10.11842/wst.2016.08.023

R917

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-01-08

修回日期：2016-01-29

＊ 北京中医药大学自主选题项目（2016-JYB-XS050）：基于血清化学成分分析的四妙勇安汤配伍研究，负责人：迟森森。

＊＊ 通讯作者：刘斌，教授，博士生导师，主要研究方向：中药（复方）有效成分（组分）发现与新药创制。