杨 蕾，陶仕英，王继峰，牛建昭，赵丕文，孙丽萍，王燕霞，武洪波，蔡欣悦，杨 阳

（北京中医药大学基础医学院 北京 100029）

PI3k/Akt通路参与二仙汤抑制顺铂所致卵巢颗粒细胞凋亡的作用＊

杨 蕾，陶仕英＊＊，王继峰，牛建昭，赵丕文，孙丽萍，王燕霞，武洪波，蔡欣悦，杨 阳

（北京中医药大学基础医学院 北京 100029）

目的：观察顺铂干预大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况，从而探讨二仙汤含药血清经PI3k/Akt通路抑制卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制。方法：SD雌性大鼠30只，随机分为3组，分别为生理盐水组、补佳乐组、二仙汤组。心脏取血，制备药物血清。SD大鼠卵巢颗粒细胞，经培养贴壁后，用顺铂损伤大鼠原代卵巢颗粒细胞。经各组药理血清作用后，应用Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡，并对各实验组大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡情况进行分析。应用免疫组化法，测定各分组PI3k、Akt、p-Akt蛋白的表达情况，并进行图像分析。结果：流式细胞凋亡结果显示，二仙汤可以降低顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡率。免疫组化结果显示，PI3k、p-Akt、Akt在细胞质内均有表达，可见棕黄色阳性物质；而二仙汤可以上调顺铂干预后大鼠卵巢颗粒细胞的PI3k、p-Akt、Akt的表达。结论：二仙汤含药血清上调了PI3k、p-Akt、Akt的表达，从而抑制了卵巢颗粒细胞凋亡，该过程可能通过调节PI3k/Akt通路实现，进而有效地保护卵巢功能。

二仙汤 卵巢颗粒细胞 PI3k/Akt通路 细胞凋亡

二仙汤是名医张伯讷教授治疗女性更年期肾阴阳两虚的常用方药，临床常用于治疗更年期综合征、更年期高血压，卵巢早衰等，疗效显著[1，2]。二仙汤主要是由仙茅、淫羊藿、巴戟天、黄柏、知母、当归六味中药组成。根据中医方剂的配伍原则，本方呈现了辛温苦寒同用，温补寒泻同施，整方温而不燥，寒而不凝，且以滋肾阴降相火、调冲任、平阴阳为所长。可达阴阳调和之效，对卵巢功能不全起到了很好的治疗作用[3]。卵巢颗粒细胞对育龄期女性的生殖功能起着重要的作用。正常卵泡生长、发育以及排卵均需要颗粒细胞的正常增殖和功能表达[4]，正常的卵巢颗粒细胞的凋亡，严重影响卵巢功能甚至形成卵巢早衰。顺铂作为抗癌药物，在临床治疗肿瘤的同时也具有细胞毒性作用。它可以破坏正常的卵巢颗粒细胞，使其发生凋亡，甚至形成卵巢早衰[5]。

PI3k/Akt信号通路是细胞增殖调控的重要通路，它主要是通过促进细胞增殖起到抗凋亡作用。该通路的抗凋亡机制主要是激活后的Akt通过直接磷酸化凋亡机器组件或间接改变编码凋亡机器组件的基因表达水平，来控制凋亡过程[6]。该通路中分子的参与调节卵母细胞生长、原始卵泡发育以及颗粒细胞的增殖、分化。而在人类卵母细胞中PI3k通路中各信号分子异常表达会导致原始卵泡生存和发育的缺陷，造成卵巢的病理状态，甚至引起POF；颗粒细胞内的PI3k/Akt信号通路对卵泡的生长和成熟有至关重要的作用，本文通过分子生物水平，重点观察二仙汤含药血清经PI3k/Akt信号通路抑制顺铂干预后大鼠卵巢颗粒细胞凋亡，从PI3k/Akt信号通路的角度探讨二仙汤含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制，探讨其可能的治疗机制。

1 材料

1.1 实验动物

22-24天健康雌性SD大鼠，共40只，体质量60±10 g，随机分为5笼，每笼10只，动物饲养在室温、自然光照的清洁级实验室内，食水充足，食用常规饲料，饮用去离子水。动物饲料均购于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，使用许可证：SCXK（京）2011-0004。

1.2 实验用药

二仙汤由淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、黄柏和知母组成。中草药由北京中医药大学东直门医院提供，按照《妇科临床方剂学》规定的剂量比（9∶6∶10∶15∶12∶10），最终按照人（60 kg）用药剂量计算大鼠用药剂量为7.5 g·kg-1；注射用顺铂（CDDP），每支10 mg（齐鲁制药有限公司，批号：411033CF）；补佳乐（雌激素）购自东直门医院，规格：1 mg/片（拜耳医药有限公司，批号：195A5）。用法与剂量：折算成大鼠所需剂量即0.009 mg·kg-1。

1.3 主要试剂

PI3k、Akt、p-Akt一抗（北京中山金桥生物技术有限公司，批号：sc-1637、sc-8312、sc-135651）；AnnexinV FITC凋亡检测试剂盒（北京欧北科技有限公司，批号：20151210004）；DAB显色剂（北京中山金桥生物技术有限公司，批号：20151016）；二抗SP-9000（羊抗兔）（北京中山金桥生物技术有限公司，批号：20150921）。

2 方法

2.1 制备卵巢颗粒细胞

22-24天的雌性SD大鼠10只，体重35 g，适应性喂养1天，注射孕马血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）50 IU/只，48 h后，在无菌条件下取出双侧卵巢颗粒细胞进行培养。具体操作如下：①取SD大鼠，经脱臼处死，浸泡75%酒精中消毒3min。②消毒后放入已消毒托盘中在超净台中取双侧卵巢，放入预冷的Hank's液2.7 mL。③用Hank's液清洗3次，将其中的脂肪、包膜等清理干净。④将卵巢移入无血清培养基中，用1 mL一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使颗粒细胞充分释放。⑤加入0.3 mL2.5%胰酶反复用吸管吹打悬液数次，使颗粒细胞团块分离。37%消化10 min（每3 min，震荡或吹打一次）。⑥加入1 mL含血清培养液终止胰酶消化，并静置10 min。取悬液加入15 mL离心管中。⑦1 000 rpm离心10 min，弃上清。加入生理盐水5 mL冲散细胞再次离心。⑧弃上清，加入10%胎牛血清0.2 mL，吹打均匀。⑨计数：应用血球小板计数，调整悬液浓度，以5×105接种于96孔板中。在37℃，5% CO2培养箱中培养。观察贴壁情况，待细胞长满瓶底至75%-80%融合时，用于实验。

2.2 制备药理血清组

22-24天的雌性SD大鼠50只，体重35-40 g，适应性喂养1天，第2天取药理血清。将药理血清动物分3组：①正常组：灌胃蒸馏水0.4 mL/天；②补佳乐组：灌胃补佳乐0.009 mg·kg-1/天；③二仙汤组：灌胃二仙汤7.5 g·kg-1/天，各组连续灌胃3天，于第4天晨起7∶00灌胃，2 h以后，心脏取血并分离血清，-20 ℃保存。

2.3 CDDP损伤颗粒细胞

待细胞生长至底壁的75%-80%时，将模型组、补佳乐组、二仙汤组的培养基吸出，每孔加入CDDP（浓度为2.5 μg·mL-1）200 μL，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养12 h。

2.4 药物干预

颗粒细胞与CDDP作用12 h后，进行给药干预，每孔加入相应的药理血清组200 μL，培养24 h，进行指标测定。

2.5 流式细胞技术检测细胞凋亡步骤

2.5.1 实验步骤

吸取培养皿的上清液转移至微型管中保存。用1×PBS洗细胞2次，收集清洗液保存。

1 mL 2.5%胰酶消化5 min。1 mL 10%胎牛血清培养基终止消化，将悬液转移至离心管，将第一步、第二步的上清一并加入。3 000 rpm离心3 min，弃上清。加入PBS后3 000 rpm离心3 min，弃上清，重复本步操作一遍。加入预先配好的1×结合缓冲液，制成终浓度为1×106 cell/mL的细胞悬液。取100 μL上个步骤中的悬液，加入到新的tube中。向细胞悬液中加入5 μL AnnexinV，FITC结合物，再加入5 μL PISolution。室温下避光培养15 min。加入400 μL 1×结合缓冲液，上流式细胞仪进行检测。

2.5.2 设定分组

A.正常组，B.模型组，C.补佳乐组，D.二仙汤组。

2.6 卵巢颗粒细胞PI3k、p-Akt、Akt免疫组化染色步骤

免疫组化染色采用SABC法，其中PI3k、p-Akt、Akt的一抗浓度均为1∶200。依次通过：96孔板每孔滴加20 μL 4%多聚甲醛固定、每孔滴加20 μL 0.5%tritox-100、1×PBS清洗、3% H2O2去离子水孵育、1×PBS清洗、滴加试剂A（封闭用正常山羊血清工作液）室温孵育，倾去，勿洗、滴加一抗，37℃孵育、1×PBS清洗、滴加试剂B（生物素化二抗工作液IgG/Bio），室温孵育、1×PBS清洗、滴加试剂C（辣根酶标记链霉卵白素工作液S-A/HRP），室温孵育、1×PBS清洗、DAB显色剂显色，最后自来水冲洗，显微镜观察。

图1 各组大鼠卵巢颗粒细胞流式凋亡情况

每孔随机选取6个视野，统一放大倍数为200倍，利用免疫组化软件包对卵巢颗粒细胞进行灰度测量分析，并测算视野内阳性目标总面积，并与视野面积相比得到阳性反应颗粒的平均光密度（Average Optical Density，AOD），即单位面积内阳性颗粒所占面积

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 各实验组对细胞凋亡率的影响

AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率证实，二仙汤含药血清作用的顺铂干预后的大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡明显降低，各实验组细胞凋亡率分别为正常组（22.5±7.77）%、模型组（48.233±11.299）%、补佳乐组（39.667± 17.906）%、二仙汤组（34.367±18.949）%。以上结果显示，二仙汤可以降低顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡率（图1）。

3.2 各组卵巢颗粒细胞PI3k、p-Akt、Akt表达的比较

免疫组化结果显示，各组PI3k在细胞质内均有表达，可见棕黄色阳性物质位于胞质内，正常组PI3k阳性细胞染色较深，呈棕色或深棕色，表达较多。模型组阳性细胞着色较浅，呈浅棕色，表达较少。补佳乐组、二仙汤组和模型组相比，阳性表达细胞着色变深，但不及正常组（图2）。与PI3k蛋白表达呈现相同的趋势，各组Akt棕黄色阳性表达位于胞浆内，其中正常组表达最多，呈深棕色；模型组Akt阳性细胞表达明显减少，呈淡棕色。补佳乐组、二仙汤组阳性细胞着色增强，而二仙汤组阳性表达最为明显，但少于正常组（图3）。与Akt蛋白表达相同，各组p-Akt棕黄色阳性表达位于胞浆内，其中正常组表达最多，呈深棕色；模型组p-Akt阳性细胞表达明显减少，呈淡棕色。补佳乐组、二仙汤组阳性细胞着色增强，而二仙汤组阳性表达最为明显，但少于正常组（图4）。

由图4可知，和正常组比较，顺铂干预后的各组PI3k均表达减少，模型组呈现极少表达现象（P＜0.05）；和模型组比较，各治疗组均可见阳性表达增强，但表达均低于正常组，其中二仙汤组阳性表达略低于补佳乐组（P＜0.05）。Akt、p-Akt与PI3k表达强度结果相同，和正常组相比较，顺铂干预后各组Akt表达均减弱，而以模型组最明显（P＜0.05）；和模型组比较，各药物组均可见Akt阳性表达增加，但弱于正常组（P＜0.05）。与Akt结果相同，p-Akt和正常组相比较，顺铂干预后各组表达均减弱，而以模型组最明显（P＜0.05）；和模型组比较，各药物组均可见p-Akt阳性表达增加，但弱于正常组（P＜0.05）。实验结果见表1。

图2 各组大鼠卵巢颗粒细胞中PI3k蛋白的表达情况（免疫组化法×200）

图4 各组大鼠卵巢颗粒细胞中p-Akt蛋白的表达情况（免疫组化法×200）

表1 各组大鼠卵巢细胞中PI3k、p-Akt、Akt蛋白免疫组化图像分析结果（±s，n=6)

表1 各组大鼠卵巢细胞中PI3k、p-Akt、Akt蛋白免疫组化图像分析结果（±s，n=6)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

PI3kAktp-Akt正常组1.421±0.047 1.449±0.043 1.079±0.001模型组1.070±0.125**1.261±0.062** 1.039±0.017**补佳乐组1.275±0.097##1.360±0.038**##1.079±0.004##二仙汤组1.273±0.11*##1.356±0.039**##1.077±0.001##

4 讨论

PI3k是由sugimoto和Maeara等发现的一种胞内磷脂酞肌醇激酶，与v-src和v-ras等癌基因的产物相关，它可以特异地使肌醇环上的3′位经基磷酸化。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因与蛋白激酶C（73%的同源性）和蛋白激酶A（68%的同源性）有同源性，而又称为蛋白激酶B（PKB）[7]。PI3k/Akt通路在细胞稳态、神经发育、新陈代谢及其他过程中均发挥着关键作用。它调节着细胞发育的各个方面，如细胞凋亡、细胞周期进程和细胞分化[8]。PI3k/Akt信号通路的抗凋亡机制学者研究了生长因子受体的下游底物PI3k和Akt的抑制凋亡能力，激活后的Akt通过直接磷酸化凋亡机器组件或间接改变编码凋亡机器组件的基因表达水平，来控制凋亡过程[9-11]。顺铂对卵巢性激素的分泌和颗粒细胞、卵泡膜内层细胞的功能均有损伤，顺铂改变了卵巢组织的稳态内环境，使其产生严重的氧化损伤效应[12]。PI3k/Akt通路能够调节细胞生长、促进细胞周期增殖、参与血管形成等，是最主要的抑制细胞凋亡的信号途径[13]。PI3k/Akt信号通路中分子的参与调节卵母细胞生长、原始卵泡发育以及颗粒细胞的增殖、分化。而在人类卵母细胞中PI3k通路中各信号分子异常表达会导致原始卵泡生存和发育的缺陷，造成卵巢的病理状态，甚至引起POF；颗粒细胞内的PI3k/Akt信号通路对卵泡的生长和成熟有至关重要的作用，而本实验观察二仙汤含药血清经PI3k/Akt信号通路抑制顺铂干预后大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡情况，发现二仙汤含药血清对顺铂干预后的大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡率产生了明显降低凋亡率的效果，经免疫组化实验检测，我们发现各实验组中大鼠卵巢颗粒细胞的PI3k、p-Akt、Akt蛋白的表达存在差异：二仙汤可以上调顺铂干预后大鼠卵巢颗粒细胞的PI3k、p-Akt、Akt的表达，从而促进细胞增殖。从我们对PI3k/Akt信号通路的了解，以及综合以上指标可看出：二仙汤含药血清可以抑制顺铂损伤的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况，考虑可能是因为二仙汤可以上调了p-Akt、Akt、PI3k的表达，达到保护卵巢的作用；但是我们只了解了二仙汤对PI3k/Akt信号通路上游蛋白p-Akt、Akt、PI3k的表达起到了上调作用，PI3k/Akt有抑制凋亡的作用，且与MAPK、PKC通路并列。PI3k/PKB可以保护细胞，对抗CD95引起的细胞凋亡；PKB磷酸化BAD（BCl-2家族的一员,具有促凋亡作用），使其失活，从而阻断了细胞的凋亡PI3k/PKB是独立于其他通路的一个新的信号转导系统,与细胞代谢、生长、凋亡、恶变等密切相关，且与Ras、G蛋白、PKc等有复杂的交互作用[14，15]。接下来我们将探讨在细胞凋亡的过程中，BAD可与BCl-2或Bax形成复合物促进凋亡，激活后的Akt是一种高效Bad激酶，探讨二仙汤是通过磷酸化哪一位点，从而阻断细胞凋亡，促进细胞增殖，并发挥其抗凋亡作用。

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Effects of Er-Xian Decoction on Cisplatin Induced Ovarian Granulosa Cells Apoptosis Through PI3k/Akt Pathway

Yang Lei, Tao Shiying, Wang Jifeng, Niu Jianzhao, Zhao Piwen, Sun Liping, Wang Yanxia, Wu Hongbo, Cai Xinyue, Yang Yang
(School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029, China)

This study aimed to investigate the effects of cisplatin on rats' ovarian granulosa (OG) cells apoptosis, and to explore the mechanism of Er-xian Decoction (EXD) behind the anti-apoptotic role of its pharmacological serum in OG cells by PI3k/Akt pathway.30 female SD rats were randomly divided into three groups, the normal saline group, the progynova group and the EXD group. Pharmacological serum was prepared after heart puncture. Prior to cisplatin stimulation, SD rat OG cells were cultivated withadherence method.When administered by pharmacological serum of EXD, AnnexinV/PI double staining flow cytometry was adopted to detect cell apoptotic situations of OG cells of all groups, and immunohistochemical technology to quantify the protein expressions of PI3k, Akt and p-Akt combined with and the image analysis.It was found that the apoptosis rate, stimulated by cisplatin, was reducedafter EXD administration according to analysis of flow cytometry. Immunohistochemical outcomes showed that PI3k, p-Akt and Akt were expressed in the cytoplasm featuring brown positive substances. EXD enhanced the expressions of PI3k, p-Akt and Akt of cisplatin-stimulated OG cells. In conclusion, EXD prohibited the apoptosis of OG cells through upregulating the expressions of PI3k, p-Akt and Akt, by which affected the PI3k/Akt pathway further and effectively protectedthe ovarian function.

Er-xian decoction, ovarian granulosa cells, PI3k/Akt signaling pathway, cell apoptosis

10.11842/wst.2016.08.020

R285

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-08-09

修回日期：2016-08-20

＊ 教育部国家外专局高等学校学科创新引智基地项目（B07007）负责人：牛建昭；国家自然科学基金委资助项目（81273887）基于PI3k/Akt信号通路探讨二仙汤治疗化疗损伤性卵巢早衰的作用机制，负责人：牛建昭；国家自然科学基金委资助项目（30772849）：报告基因技术研究二仙汤的雌激素作用机制和配伍规律，负责人：王继峰。

＊＊ 通讯作者：陶仕英，副教授，研究生导师，主要研究方向：中医药防治女性生殖内分泌疾病基础研究。