邵千枫，李昱颉，曹 瑾，卢梦晗，吕 威，景泉凯，李 悦，李志刚

（北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029）

“通督启神”法两种电针对APP/PS1小鼠额叶皮层小胶质细胞TNF-α表达的影响＊

邵千枫，李昱颉，曹 瑾，卢梦晗，吕 威，景泉凯，李 悦，李志刚＊＊

（北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029）

目的：观察“通督启神”法不同电针对APP/PS1小鼠学习记忆能力及额叶皮层MG与TNF-α表达的影响，探讨不同电针治疗AD的疗效差异及其作用机制。方法：APP/PS1小鼠随机分为模型组、脉冲电针组和音乐电针组，C57BL/6小鼠为正常对照组，每组8只。先取“人中”点刺，后取“百会”、“印堂”二穴，连接脉冲电针及音乐电针，留针20 min。正常对照组与模型组同样方法束缚20 min。治疗15天后，用Morris水迷宫检测小鼠的行为学变化，免疫组化观察小鼠额叶皮层小胶质细胞活化情况，Western Blot检测小鼠额叶皮层TNF-α的表达含量。结果：“通督启神”法不同电针均可显著改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力（P＜0.05），降低AD小鼠额叶皮层小胶质细胞标记物Iba-1的表达（P＜0.05）及TNF-α蛋白的表达（P＜0.05），且音乐电针组均优于脉冲电针组（P＜0.05）。结论：“通督启神”法不同电针可有效改善APP/PS1小鼠学习记忆能力，抑制小胶质细胞活化、减少TNF-α的分泌，且音乐电针在改善额叶皮层炎性反应方面优于脉冲电针，对AD有更好的治疗效果。

通督启神 音乐电针 脉冲电针 AD MG TNF-α

阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是以进行性记忆丧失、认知障碍、人格改变等为特点的起病隐匿的中枢神经系统变性疾病[1]。相关研究表明[2]，大量活化小胶质细胞（Microglia，MG）的聚集已成为阿尔兹海默病的重要病理改变之一。由于MG不断激活，促使大量的致炎细胞因子持续过度的释放（如TNF-α），加速神经元损伤甚至凋亡，并启动脑内一系列炎性级联反应，加大AD脑内局部炎性，从而加速病程发展[3，4]。为探究电针是否可以作为有效的抗炎手段，通过减少AD模型小鼠大脑额叶小胶质细胞的过度活化及TNF-α的表达，从而改善小鼠的学习记忆能力。本实验从抑制小胶质细胞活化的角度来阐述电针对AD模型小鼠的影响，探讨“通督启神”法不同电针治疗AD的可能作用机制，并比较两种电针的疗效差异，为临床应用的选择提供一定的理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

选取SPF级健康雄性7月龄双转基因APP/PS1（Amyloid Precursor Protin/Presenilin-1）小鼠24只随机分成3组，分别为模型组、脉冲电针组及音乐电针组，每组各8只；以8只相同背景相同月龄的C57BL/6作为正常对照组。动物从南京大学南京生物医药研究院模式动物研究所购入，批号：SCXK（宁）2010-0001，体质量24.6±4.3 g，饲养于北京中医药大学动物中心屏障系统单笼。

1.2 主要试剂与仪器

韩式电针仪HANS-202型（南京济生医疗科技有限公司）；音乐电针治疗仪ZJ-12H音乐电针治疗仪（深圳市圣祥高科技有限公司）；ZYTH2013030504无菌针灸针（中研太和牌，规格0.25 mm×13 mm，批号：511526）；XR-XM101型Morris水迷宫图像自动采集和软件分析系统（上海欣软信息科技公司）；自制鼠套（规格：8 cm长，宽4 cm，头部用双层纱布缝制呈三角形透气网）。

1.3 治疗方法

脉冲电针组将AD小鼠用自制的鼠套进行固定，参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”选取百会、印堂、人中三穴。用华佗牌30号1寸毫针先在人中穴点刺，后在百会、印堂穴进行交叉平刺（两针不能相碰，以防短路），进针深度0.5 cm，针柄连接HANS-202电针仪，频率2 Hz，以小鼠头部微微颤动为宜，每次20 min，每天上午9∶00开始进行一次治疗，共15天。

音乐电针组以相同方法束缚并针刺，针柄连接ZJ-12H音乐电针仪，选取节奏明朗的痴呆治疗处方，以小鼠不挣扎撕咬保持安静为宜，每次20 min，每天上午9∶00开始进行一次治疗，共治疗15天。

正常对照组和模型组在治疗时抓取一次并用相同鼠套进行束缚20 min，共15天。

1.4 Morris水迷宫检测

Morris水迷宫为一高24 cm、半径60 cm的圆形水池。试验中水深度为29 cm，水温22±2 ℃，水内加入奶粉使水成为透明乳白色，以看不见池底利于摄像分辨为度。水池内水面平均分为4个象限（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ象限），圆柱平台位于目标象限（Ⅲ）的中央，低于水面1 cm，水池上方设有摄像机将所收集信号输入计算机，进行图像自动采集和处理。

1.4.1 隐蔽平台实验

在水迷宫实验的前一天，撤离目标象限平台，让每只小鼠在水池内进行60 s的游泳训练。实验开始时，小鼠入水前先将其放在平台上10 s以熟悉环境，再将小鼠以第Ⅳ象限池壁中央位置的入水点面朝池壁放入水中，登台停留5 s后，计算机自动记录时间，在60 s内小鼠找到平台的时间即为逃避潜伏时，超出且没有登上平台则记为60 s，连续测试5天。

1.4.2 空间探索实验

在隐蔽平台实验结束后1天，将位于第Ⅲ象限的平台拆除，将小鼠依次从第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限的池壁中点位置放入水池中，记录小鼠60 s内在原平台象限的游泳时间及路程。

1.5 脑组织取材及相关指标检测

水迷宫实验结束后，随机取4只小鼠，用10%的水合氯醛进行腹腔注射，快速断头处死后取出脑组织，冰上分离出大脑皮层额叶部分置于灭菌冻存管，进行Western Blotting半定量分析。Western Blotting检测额叶皮层TNF-α，在收集的大脑额叶皮层组织匀浆中加入含有1 mmol·L-1PMSF的蛋白裂解液提取组织的总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。计算上样量，样本（30 μg）进行SDS-PAGE电泳，转印蛋白至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭，加入一抗4℃过夜，第2天洗膜，加二抗室温孵育1 h，加发光液，曝光后显影定影，扫描胶片，用Quantity One软件进行分析。采用Gel Doc Analysis对其光密度进行测定和分析，对各组的TNF-α蛋白相对量（TNF-α/ GAPDH 灰度值）进行比较。

免疫组化DAB染色：将其余4只小鼠取整脑，放入于4%多聚甲醛中，酒精梯度脱水，石蜡包埋，做切片。石蜡切片经常规脱蜡处理后，枸椽酸缓冲液进行抗原修复20 min，PBS漂洗，3%H2O2室温孵育10 min，PBS漂洗；正常非免疫羊血清 37℃孵育10 min；一抗兔抗Iba-1多克隆抗体1∶200加于切片上，4℃冰箱孵育过夜；第2天PBS漂洗，生物素标记的羊抗兔 IgG37℃孵育 10 min，PBS 漂洗；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶37℃孵育10 min，PBS漂洗；DAB显色试剂盒显色，显微镜下观察并终止显色；苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，留以观察。以额叶皮层部分为图片分析区域，每组取相互不重叠的8个视野，用Image Pro Plus 6.0图像分析系统进行图像处理，计数其中阳性细胞，每组小鼠所有切片阳性细胞数量作为该组动物免疫阳性细胞密度代表值，以阳性细胞数表示。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果

2.1.1 隐蔽平台实验

从表1、图1、图2可见，随着天数的增加，各组逃避潜伏时间呈减少趋势。前两天治疗后电针组和音乐电针组与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），第2天治疗后正常对照组和音乐电针组与模型组差异均有统计学意义（P＜0.05），第4天治疗后正常对照组、电针组、音乐电针组与模型组差异均有统计学意义（P＜0.05），且正常对照组的逃避潜伏时最短，其次是音乐电针组和电针组，模型组的逃避潜伏时最长。

2.1.2 各组小鼠目标象限游泳时间及目标象限游泳距离的比较

从表2、图3可见，正常对照组的目标象限游泳时间最长，其次是音乐电针组和脉冲电针组，模型组的目标象限游泳时间最短，且正常对照组、脉冲电针组和音乐电针组与模型组小鼠目标象限游泳时间的差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，正常对照组目标象限游泳距离最长，其次是音乐电针组和脉冲电针组，模型组的目标象限游泳距离最短，且脉冲电针组和音乐电针组与模型组小鼠目标象限游泳距离差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组小鼠额叶皮层小胶质细胞Iba-1免疫组化染色结果

如图4、表3所示，小胶质细胞的Iba-1免疫组化染色阳性表达胞质、胞膜棕褐色深染。正常对照组Iba-1阳性表达量最低，小胶质细胞呈分枝状，细胞胞体小，细胞突起细长；模型组的小胶质细胞Iba-1阳性表达增强且阳性细胞数量显著增高，大量小胶质细胞胞体变大，呈椭圆形，细胞突起变粗，呈现“灌木丛”样高分支状，明显与其他组相比较小胶质细胞活化量最多。与模型组相比电针组和音乐电针组的Iba-1阳性表达量明显减少（P＜0.05）。

表1 各组小鼠Morris水迷宫实验第4象限入水点逃避潜伏时的比较（±s，n=8）

表1 各组小鼠Morris水迷宫实验第4象限入水点逃避潜伏时的比较（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05。

组别第1天/s第2天/s第3天/s第4天/s正常对照组 49.38±19.72 49.00±20.40 45.50±17.99 39.69±21.94模型组60.00±0.00*60.00±0.00*60.00±0.00*59.13±2.47*电针组60.00±0.00 60.00±0.00 55.38±9.05 40.57±26.84#音乐电针组58.38±4.60 58.00±5.66 46.05±16.03# 38.32±6.47#

图1 各组小鼠Morris水迷宫实验第四象限入水点逃避潜伏时比较（±s，n=8）

图2 隐蔽平台实验各组小鼠搜索轨迹

表2 各组小鼠Morris水迷宫实验目标象限游泳时间、目标象限游泳距离比较（±s，n=8）

表2 各组小鼠Morris水迷宫实验目标象限游泳时间、目标象限游泳距离比较（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，与模型组比，#P＜0.05。

组别 标象限游泳时间/s目标象限游泳距离/cm正常对照组21.60±2.38 486.54±60.39模型组 9.59±0.21* 208.85±11.85*电针组13.43±0.28#342.97±13.01#音乐电针组16.64±0.69#390.97±17.60#

表3 各组小鼠额叶皮层小胶质细胞Iba-1免疫组化染色表达变化（±s，n=8）

表3 各组小鼠额叶皮层小胶质细胞Iba-1免疫组化染色表达变化（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别阳性细胞数（个）正常对照组 2.38±1.51模型组24.25±3.11*电针组10.25±3.28#音乐电针组 7.25±3.11#

2.3 Western blot 检测结果

如图5、图6所示，为各组小鼠额叶皮层TNF-α蛋白表达含量比较。与正常组比较，模型组条带明显增粗，蛋白表达明显变多（P＜0.01）；与模型组相比，电针组和音乐电针组的蛋白表达明显下降（P＜0.05）；音乐电针组比电针组条带明显增粗，蛋白表达含量略降低（P＞0.05），两者差异没有统计学意义。

3 讨论

近年来的研究表明，脑内神经炎性反应是导致AD神经细胞变性的重要病理机制[5]。其主要特征是脑内胶质细胞过度激活和大量神经炎性因子的释放，而MG在神经炎症反应中发挥主导作用[6]，在AD中为始动因子和促进因素，是引起AD中炎症反应的核心。

图3 各组小鼠Morris水迷宫实验目标象限游泳时间、目标象限游泳距离比较（±s，n=8）

图4 各组小鼠额叶皮层小胶质细胞Iba-1免疫组化染色表达（×400）

MG是中枢神经系统中重要的免疫效应细胞，一般情况下MG呈分枝状，胞体较小，起免疫监视的作用。随着AD的发展，大量沉积的Aβ可以激活MG，形成胞体较大、凸起较短的阿米巴状或呈现“灌木丛”样高分支状，进而产生一系列神经毒性物质和大量的致炎性细胞因子，这些炎性因子反过来又可以作用于MG和神经元，形成炎性级联反应，加速AD的发展。研究发现，AD患者大脑皮层老年斑周围存在大量活化的MG和明显的炎性反应标志物，MG数量及活化程度与AD的临床症状具有很强的相关性[7，8]。而TNF-α是MG炎性反应过程中释放的主要促炎性因子，可以有效反应MG活化程度。本文通过实验观察“通督启神”指导下的脉冲电针和音乐电针疗法影响MG活化与TNF-α蛋白的表达情况，及行为学变化，来探求验证不同电针对治疗AD的影响和作用机理。

“通督启神”法是基于脑、神、督脉之间的密切联系所提出的，以“通督”为手段，“启神”为目的针灸疗法，在治疗与“脑”相关的精神神志类疾病有明显效果。本法选取百会、印堂、人中三穴作为主穴，百会又名三阳五会，为手足三阳、督脉、肝经交汇之处，《针灸资生经》：“百病皆主”，具有镇惊熄风，安神健脑的效果。印堂位于“两眉苑苑中”，为督脉经奇穴，具备镇惊醒神的功能。人中又名水沟，上行入脑，是督脉与手足阳明经的交汇之穴，起到醒神开窍的疗效。三穴合用，共奏通督启神之效。

音乐电针是一种集合了音乐疗法、电疗法及针刺疗法于一身的新疗法，采用音乐声波作为输出波形，将音乐信号转换为与音乐风格和特点同步的低中频混合电流，频率和振幅随音乐的变化而不断变换，每时每刻都形成一种新的刺激，机体来不及适应立刻又转入另一个新的刺激，既具有刺激经穴和音乐治疗的双重作用，又克服了普通脉冲电针易产生耐受性的特点。

本课题组在既往的实验中已经证实了“通督启神”电针法和音乐电针法能够降低SAMP8小鼠的Aβ含量而有效改善AD模型小鼠的学习记忆能力[9，10]。本研究则采用已经出现空间学习障碍和认知功能损伤的7月龄APP/PS1双转基因小鼠作为模型[11，12]，且该小鼠脑内Aβ沉积时间较早、Aβ斑块周围存在大量活化的小胶质细胞并随年龄增加进行性加重[13]。实验结果显示，在改善学习记忆能力方面，音乐电针组在第3天开始逃避潜伏时明显缩短，脉冲电针组在第4天开始缩短。而目标象限游泳路程与时间表明，音乐电针组均少于脉冲电针组。“通督启神”法不同电针均可以改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力，且音乐电针组明显优于脉冲电针组；在减低炎性反应方面，“通督启神”法脉冲电针组和音乐电针组均可降低额叶皮层MG标记物Iba-1的表达及TNF-α蛋白的含量，且音乐电针的调节优于脉冲电针，提示其在治疗AD的有效性可能与抑制小胶质细胞活化从而减少促炎性因子的释放有关，且音乐电针在改善脑内炎性反应方面优于脉冲电针。这也可能是音乐电针治疗AD的有效途径之一，但其具体的机理有待进一步的实验研究来证明，下一步我们将深入研究有关小胶质细胞表面受体TREM2诱导的相关通路，探究音乐电针治疗AD的具体作用机理。

图5 各组小鼠额叶皮层TNF-α表达情况

图6 各组小鼠额叶皮层TNF-α水平的影响（±s，n=8）

参考文献

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Effects of Two types of Electro-acupuncture Treatments Based on "Tongdu Qishen" Theory on the Expressions of Microglia and TNF-α in Frontal Cortex in APP/PS1 Double Transgenic Mice

Shao Qianfeng, Li Yujie, Cao Jin, Lu Menghan, Lyu Wei, Jing Quankai, Li Yue, Li Zhigang
(School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This study aimed to investigate the effects of "Tongdu Qishen" of music electro-acupuncture (EA) combined with music therapy and EA combined with pulse therapy on the spatial learning and memory and the expression of microglia and TNF-α in the frontal cortex in APP/PS1 double transgenic mice, and to explore the their mechanisms underlying the treatment of EA for Alzheimer’s Disease (AD). Twenty-four male APP/ PS1 transgenic mice were equally and randomly divided into the model group, the EA treatment group and the music EA group, while 8C57BL/6 mice were selected as the control group. In EA treatment group, GV20-Baihui and GV29-Yintang were stimulated by EA with the frequency of 2 Hz combined with music or pulse therapy, lasting for 20 min every day. Then, swift pricking blood therapy was performed at GV26-Shuigou prior to EA treatment. Mice in the control group and the model group had been restrained for 20 min each day. After 15-day’s treatment, morris water maze test was adopted to observe the ethological changes of mice in each group. The expression of microglia in the frontal cortex was detected by immunohistochemistry technology, while western blot was applied to quantify TNF-α in frontal cortex. It was found that spatial learning and memory in mice of the music-EA group was improved compared with the EA group (P ＜ 0.05). Compared with the model group, the number of IBA-1-immunopositive cells was decreased in the EA group and the music-EA group (P＜ 0.05). Western blot detection showed that TNF-α expression in frontal cortex of mice in the model group was higher than that in the control group (P ＜ 0.05). After the treatment, the TNF-α expression in both the EA groupand the music-EA group was down-regulated. In conclusion, it was demonstrated that the treatments of pulse-EA and music-EA rested on “Tongdu Qishen” theory improved the spatial learning and memory of APP/PS1 double transgenic mice and inhibited the activated microglia and TNF-α expression in the frontal cortex. Music-EA therapy offered a better performance in allaying cerebral inflammation than pulse-EA treatment.

Tongdu Qishen, electro-acupuncture combined with music therapy, electro-acupuncture combined with pulse therapy, Alzheimer's disease, microglia, TNF-α

10.11842/wst.2016.08.016

R228

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-08-19

修回日期：2016-08-20

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81473774）：基于“通督启神”法探讨不同电针对AD模型小鼠不同脑区小胶质细胞活化通路的影响，负责人：李志刚；国家自然科学基金委重大项目（81590952）：穴位敏化的客观显像研究，负责人：李志刚。

＊＊ 通讯作者：李志刚，博士，教授，博士生导师，主要研究方向∶针刺干预中枢神经系统损伤的机理研究。