杨　强，唐　洁，杨生智，夏金阳，王　喆，刘源才(劲牌有限公司，湖北大冶435100)



清香型小曲白酒产酯酵母的筛选及应用

杨强，唐洁，杨生智，夏金阳，王喆，刘源才
(劲牌有限公司，湖北大冶435100)

摘要：从酒曲中分离的多株酵母，通过液态发酵初筛、小试固态发酵复筛获得高产乙酸乙酯酵母。将产酯酵母应用于生产中，研究其对清香型小曲白酒发酵的影响。采用高粱汁液态发酵，结合风味物质初筛出7株产乙酸乙酯性能较好的酵母菌株。在实验室模拟小曲白酒生产工艺搭建小试固态发酵平台，通过对7株酵母小试固态发酵复筛，测定发酵结束后蒸馏液中乙酸乙酯含量，获得4株高产乙酸乙酯产酯酵母，均比对照组提高了近4倍以上。并将复筛获得的3株酵母扩大培养制备成酵母麸皮种，按比例添加至公司酒曲中，应用于中试车间生产，与对照酒曲（不添加产酯酵母）相比，出酒率均未受添加产酯酵母影响而下降。其中，添加Y29和Y42 2株酵母产酒中乙酸乙酯含量分别为2.004 g/L、1.523 g/L，比对照组提高了99.4 %和51.5 %，正丙醇含量分别下降44.2 %和42.7 %，而Y29高级醇含量提高了16.5 %，其他色谱指标无明显差别。

关键词：产酯酵母；乙酸乙酯；清香型小曲白酒；酒质酒率；酿酒生产

优先数字出版时间：2015-11-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151104.1110.010.html。

酯类作为呈香物质，在白酒的香气形成中具有极其重要的作用,是区别于其他蒸馏酒的主要特征之一。乙酸乙酯是小曲白酒中重要的风味化合物，是清香型小曲白酒的特征香味成分之一。乙酸乙酯在酯类物质中处于主导地位，其含量高低很大程度决定着清香型白酒的质量及风格。在小曲原酒中，乙酸乙酯含量高的酒香味好，提高乙酸乙酯含量有利于提高原酒质量。与大曲酒相比，清香型小曲原酒中的酯含量较低，具有较大的提升空间。通过进一步提高小曲原酒中乙酸乙酯含量，有利于提高小曲白酒质量，从而提升产品竞争力。同时，可以解决困扰小曲白酒行业所产原酒中酯含量低的难题，促进行业的发展，对小曲白酒传统技术的改造和提升都有着积极的现实意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1酵母菌株

从实验室收集酒曲、酒醅中分离得到。

1.1.2培养基

WL培养基：酵母浸粉0.4 %，蛋白胨0.5 %，葡萄糖5 %，磷酸二氢钾0.055 %，氯化钾0.0425 %，氯化钙0.0125 %，氯化铁0.00025 %，硫酸镁0.0125 %，硫酸锰0.00025 %，溴甲酚绿0.0022 %，琼脂2 %，pH6.5，121℃灭菌20 min。

YPD培养基：2 %葡萄糖，2 %蛋白胨，1 %酵母膏，2 %琼脂，121℃灭菌20 min。

液体YEPD培养基：葡萄糖2 %，酵母膏1 %，蛋白胨2 %。

高粱汁培养基：高粱∶水=1∶4，然后水浴糖化，过滤，稀释到10°Bx。

1.2实验方法

1.2.1酵母菌株的分离纯化

称取10 g酒醅于90 mL无菌生理盐水的三角瓶中（装有玻璃珠），200 r/min振荡浸提30 min，吸取上清液，稀释到合适浓度，一般稀释3个浓度梯度，取200 μL涂布，所有平板作3次重复。30℃培养5 d后，利用酵母在WL培养基的不同形态特征进行初步分类。待长出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离2～3次，经镜检为纯种后分别转入YPD固体斜面，低温保存。

1.2.2液态发酵初筛

将分离纯化后的酵母以相同的接种量(酵母数量为1×107cfu/mL)分别接入装有50 mL的高粱汁培养液中，然后装发酵栓并称重，置于30℃培养箱中恒温培养，每隔24 h振荡并称重，记录失重量，当失重量小于0.2 g时，停止培养。发酵结束后，测发酵液理化指标及风味物质含量。

1.2.3小试固态发酵复筛

实验室模拟小曲白酒生产工艺搭建小试固态发酵平台，具体工艺流程：泡粮、初蒸、焖粮、复蒸、撒曲、糖化、发酵，其中蒸粮结束后要求粮食开口好，完全透心，一致性好，水分在55 %左右。发酵7 d结束后，固态蒸馏，馏液经GC测乙酸乙酯含量。

1.2.4生产应用

酵母通过试管种、摇瓶培养、发酵罐培养至种曲机扩大培养制备成酵母麸皮种，再按比例添至酒曲中作为酒曲应用于中试车间进行发酵，出酒后经GC测挥发性风味物质，并进行感官品评。

2结果与讨论

2.1液态初筛结果

根据酵母的作用，大致可将酵母分成两大类。一类是酿酒酵母，主要完成酒精发酵，具有较高的发酵速率和完全的发酵能力。另一类是非酿酒酵母，虽然其发酵效率较低，但能够合成多种酶，将原料中的前体物质转换成风味物质如酯、酸、高级醇和醛等产物，影响酒的感官品质。通过考察不同酵母菌对糖的利用率及CO2失重情况可判断该菌株发酵性能的优劣，考察酵母菌株产乙酸乙酯含量鉴别菌株是否为产酯酵母。

表1各种属酵母发酵能力比较

从表1可看出，Y32、Y33 2株酵母产气较强，且残糖也较低，代谢产乙酸乙酯含量低，说明该2株酵母对糖利用率较高、发酵性能好，并不是产酯酵母；Y42产乙酸乙酯能力最强，发酵液中乙酸乙酯含量为1.04 g/L，其次是Y46，乙酸乙酯含量为0.89 g/L。此外，Y6、Y4、Y29、Y10 和Y9产酯性能也较好。可判定此7株酵母为产酯酵母，且除Y46外，其余6株酵母也具有一定的发酵能力。

2.2小试固态发酵复筛

将液态发酵初筛产酯性能较好的7株酵母制备成麸皮二级种，再按比例配成酒曲，对照曲为不添加产酯酵母的酒曲。经过泡粮、蒸粮、焖粮、糖化、发酵、蒸馏，发酵结束后蒸酒，酒样色谱结果中乙酸乙酯含量见表2。乙酸乙酯含量取平均值见图1。

根据色谱结果分析，与对照相比，Y4、Y6和Y93株酵母在小试固态发酵产酒中乙酸乙酯含量与对照组相当，提高不明显。Y42产乙酸乙酯含量最高，平均为271.01g/100g醅，其次为Y46，乙酸乙酯含量为255.13 g/100 g醅，这与液态发酵该2株酵母产酯一致。此外，Y10、Y29 2株酵母代谢产乙酸乙酯能力也较好，4株酵母产酯性能均比对照组提高了近4倍以上。

表2酵母菌的产酯情况　(g/100 g醅)

图1酵母菌的产酯情况

2.3中试车间应用

小试发酵确定的4株酵母用种曲机扩大培养制备成酵母麸皮种后，按比例添加至酒曲中应用于中试车间进行发酵，并以公司生产所用酒曲为对照。每天投粮量180 kg，每株菌连续投料3批，发酵16 d，与当月酒曲产酒进行色谱指标平均值及酒率（折55 %vol）做比较，得出数据见表3。

表3不同酵母应用于中试车间产酒主要风味物质　(g/L)

从表3、图2可知，酒曲中添加产酯酵母Y10，出酒率下降了1.95 %，而添加Y29和Y42，对出酒率无影响；添加产酯酵母，产酒中乙酸乙酯含量均有不同程度的提高，以添加Y29的乙酸乙酯含量最高，为2.004 g/L，比对照组提高了99.4 %；添加Y42酒曲产酒中乙酸乙酯浓度为1.523 g/L，比对照组提高了51.5 %，而添加Y10的酒曲出酒乙酸乙酯比对照组提高了24.3 %。另外，添加产酯酵母后正丙醇含量均比对照组减少，Y10、Y29和Y42分别下降了52.8 %、44.2 %和42.7 %，这对降低原酒中缺陷性成分——正丙醇有所贡献；添加产酯酵母后，杂醇油稍微有所提高，其中添加Y29的高级醇含量提高了16.5 %。将原酒进行感官品评，添加产酯酵母的酒曲产出的原酒清香纯正、入口醇甜、较干净，比对照曲酒体风味更优。因此，在酒曲中添加产酯酵母，对于提高小曲白酒的乙酸乙酯含量有一定的作用，在不影响出酒率情况下，进一步提升了原酒质量。

图2不同酵母应用于中试车间酒质酒率情况

3　结论

通过液态发酵初筛、小试固态发酵复筛从酒曲中获得4株高产乙酸乙酯酵母菌株，并将其中3株应用于中试车间，出酒后，乙酸乙酯含量均比不添加产酯酵母的酒曲有所提升，其中编号Y29乙酸乙酯含量提高了99.4 %，且添加产酯酵母后正丙醇含量均比对照组减少。出酒率方面，除添加编号Y10酵母略有下降外，其余2株无影响。后期可以调整产酯酵母的添加比例来消除对出酒率的影响。感官品评，添加产酯酵母后，比对照组酒体风味更优。因此，将产酯酵母制备麸皮种添加至酒曲中应用于小曲白酒生产，可以有效地改善小曲白酒中酯含量低的缺点，进一步提升了小曲白酒酒质。

参考文献：

[1]胡家俊.高产乙酸乙酯酵母的菌种选育[J].食品与发酵科技，2010(6)：81-83.

[2]严锦.小曲中产酯酵母的分离鉴定及其在酿酒生产中的应用[J].酿酒科技，2014(2)：46-52.

[3]董士伟.豉香型白酒中产酯酵母的筛选与应用[J].中国酿造，2012(2)：125-128.

[4]唐洁.酿酒酵母和异常毕赤酵母混菌发酵对白酒液态发酵效率和风味物质的影响[J].微生物学通报，2012(7)：79-81.

Screening and Application of Ester-producing Yeast Strains in the Production of Qingxiang Xiaoqu Baijiu

YANG Qiang, TANG Jie, YANG Shengzhi, XIAJinyang, WANG Zhe and LIU Yuancai
(Jingpai Co.Ltd., Daye, Hubei 435100, China)

Abstract:In this study, among the multiple yeast strains isolated from liquor starter, 7 yeast strains with good performance of ethyl acetate yield were obtained through primary screening by liquid fermentation (liquid fermentation of sorghum juice) combined with flavoring compounds evaluation, then after secondary screening by small-scale solid fermentation, 4 yeast strains with highyield of ethyl acetate were finally obtained, and the yield of ethyl acetate by those 4 yeast strains increased by almost 4 times than the contrast groups. Then 3 yeast strains were used for expanding culture and prepared as yeast bran species, and they were added in liquor starter for medium-scale production test according to certain addition ratio. Compared with contrast liquor starter, liquor yield did not decrease, and ethyl acetate content in the produced liquor increased by 99 % to 2.004 g/L for Y29 and by 51.5 % to 1.523 g/L for Y42 respectively, N-propanol content decreased by 44.2 % and 42.7 % respectively, while higher alcohol content increased by 16.5 % for Y29, and there was no significant difference in other chromatographic data.

Key words：ester-producing yeast strains; ethyl acetate; Qingxiang Xiaoqu Baijiu; liquor yield and liquor quality; liquor-making

通讯作者：刘源才，男，博士，劲牌有限公司技术总监，主要从事保健酒研发和天然提取物方面的研究。

作者简介：杨强，男，湖北浠水人，硕士，总工程师，中酒协、中食协白酒国家评委。

收稿日期：2015-09-22

DOI：10.13746/j.njkj.2015385

中图分类号：TS261.1；TS262.3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）01-0078-03