吴赫川，林　艳，马莹莹，周　健，张宿义，杨建刚(.四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000；.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000)



籼米清酒酿造研究

吴赫川1，林艳1，马莹莹1，周健1，张宿义2，杨建刚1
(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000)

摘要：以籼米为原料，米曲霉（Aspergillus oryzae）为菌种制曲，应用清酒酵母制备酒母，发酵酿造籼米清酒。结果表明，籼米经过精米处理后，适合制备米曲，其糖化酶活力达608.895 U/g，液化酶活力达187.08 U/g。精白后的籼米曲用于制备超短期酒母，其还原糖含量(10.16 g/100 mL)和酵母数(5.11亿个/ mL)均达到清酒中高温糖化酒母的理化指标要求(还原糖8.9 g/100 mL，酵母数2亿个/ mL）。以这种籼米曲酿制的清酒酒度达15 %vol左右，在其酒体中共检出18种挥发性成分，主要为醇类和酯类物质，其中以异戊醇、苯乙醇和辛酸乙酯的相对百分比含量较高。

关键词：籼米；清酒；挥发性物质；米曲霉

优先数字出版时间：2015-10-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151022.1512.007.html。

近年来，随着人们健康保健意识的增强，人们对食品的营养保健作用越来越重视。适度饮酒能够促进体内血液循环，增进食欲，缓解压力，现如今广大的消费者倾向于选择营养丰富且酒精度低有益于身体健康的发酵酒。清酒作为以大米为主要原料的发酵酒之一，含有百余种微量成分，对癌细胞的增殖有抑制作用，也有令女性保持肌肤水润的效果，清酒在国际的知名度得到显著提升[1]。

大米是我国的主要粮食,也是我国传统的酿酒原料之一。水稻作为四川主要的经济农作物之一，种植面积广，尤其是籼稻的种植面积（9.8 %）占全国前几位[2-3]。由于籼米的米粒结构松散、黏性差、膨胀性大、食用品质差，导致籼米库存过大，造成粮食资源的浪费和巨大的经济损失[4-5]。因此开发附加值高的籼米副产品，是加强原料综合利用节约成本的有效途径。清酒和黄酒都是以大米为原料的发酵酒，大米的品种与清酒的酒质、风味关系密切，因此，在清酒的酿造过程中对米种的选择比较讲究，生产优质的清酒就需要用清酒的专用米[6-10]。清酒酿造中多是采用粳米，而黄酒的酿造可以是籼米、粳米、糯米。黄酒虽有“中国酒中的瑰宝”的美誉，但却不及日本清酒在市场上的影响力。原因就在于我国黄酒中氨基甲酸乙酯的问题尚待解决，它对我国黄酒产品的质量有着极其重大的影响。其次，我国黄酒酿造方法独特，在酿造过程中加入了一定的中药成分来增加它的营养保健作用，这对于年轻的消费群体来说，它几乎没有优势。因为现今年轻的消费者更青睐于清新自然的酒体风格，而这正是日本清酒所推崇的理念。日本清酒现在具有广泛的国内及国际市场，近年来，随着我国清酒进口量不断上升，新一代群体嗜好的演变，促使日本清酒在我国市场占有越来越大的比例。因此，开发出一种中国式清酒来丰富我国的酒类饮料市场已迫在眉睫。日本的科学家们对清酒的酿造原料与工艺的研究还在不断地深入，科学家们通过育种培育出的清酒的酿造用米品种就达数百种之多，这也就是好酒出自好原料的原因之所在。“好酒”即好的口味、好的风味，现如今酒的风味质量成为当前酿酒界最关心的问题，白酒专家徐岩撰文指出，白酒风味物质研究分析引领白酒基础研究前言[11]。不同品种大米酿造的酒产生的风味不同，选择何种大米有助于提高产品风味质量，这是酿造师与研究学者们正在努力的方向。迄今虽已有部分学者对大米的酿酒特性有一定的研究，但其酿造工艺大多是借鉴黄酒酿造工艺，本课题以籼米为原料，以米曲霉菌为唯一制曲菌种，借鉴日本清酒酿造工艺，酿造出中国式籼米清酒，为探索开发一种新型低酒精度饮料奠定一定的基础，以期为丰富我国的酒类饮料市场做出一些贡献。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

菌种：米曲霉(Aspergillus oryzae)A52820121203，实验室保藏；清酒酵母，实验室保藏。

大米：南方市售籼米，籼米原料分不经过精米处理的籼米与经过精白处理的精米籼米（精白度70 %～80 %）；酿造用水，符合GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》。

试剂和仪器：恒温培养箱(LHP-250)，常州普天仪器制造有限公司；高温蒸汽灭菌锅(SYQ-DSX-280B)，申安医疗器诫厂；气相色谱-质谱联用仪，安捷伦公司6890 GC和5975 MS；色谱柱DB-WAX (60 m×250 μm ×0.25 μm)(美国Angilent公司)；SPME手动进样手柄及萃取头,购于上海安谱科学仪器有限公司；萃取头为50/ 30 μm DVB/CAR on PDMS,由美国Supelco公司制造；TM05精米机：佐竹机械（苏州）股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1精米及米曲霉种曲的制备

精米籼米经精米机（TM05）精米处理得到精白度70 %～80 %的精白米籼米（下称精白籼米）和不经过精米机处理的籼米（下称籼米），用于制曲及酿造原料。

工艺流程：原料（籼米）→淘洗→浸泡→沥水→分装三角瓶→蒸米→接种米曲霉菌悬液→培养→扣瓶→孢子长满米粒→培养结束→计孢子数。

工艺说明如下，洗米：洗去米粒表面的杂质。浸米：由于籼米的吸水性较差，需浸泡时间15 h以上，浸泡完成后，籼米捞出，沥干水后分装蒸米。蒸米：用高压蒸汽灭菌锅蒸米，条件为110℃，40 min。使蒸出的籼米熟而不烂，内无白心生米。接种：以无菌操作的方式用接种环将米曲霉菌种斜面上的孢子轻轻刮下制成合适浓度的孢子悬液，接种时，以孢子悬液的形式进行接种。添加木灰：以无菌操作的方式加入1 %木灰，拌匀。种曲培养：接种后第1天为米曲霉孢子的萌发阶段，温度为31℃，相对湿度为75 %，第2天温度为35℃，相对湿度75 %，第3天温度为30℃，相对湿度75 %,第4天温度为30℃，相对湿度75 %至培养结束，培养时间共5～6 d，培养结束时一般肉眼可观察到大量黄绿色米曲霉分生孢子的生成。扣瓶：米曲霉是一种好氧性微生物，其菌丝在生长时会相互缠绕，造成米粒结块，导致曲料内部缺氧，因此需及时扣瓶，将结块的米粒打散。本试验的扣瓶频率为1次/12 h，当有孢子萌发时停止扣瓶。

1.2.2米曲霉酒曲的制备

工艺流程：原料（籼米）→淘洗→浸泡→沥水→分装三角瓶→蒸米→降温→接种米曲霉种曲→培养→扣瓶→培养结束→测定酶活力。

工艺说明如下，接种：大米蒸好后，取出冷却至35℃，以无菌操作的方式，加入0.25 %的种曲。培养：培养温度为37℃，相对湿度75 %，培养56 h。扣瓶：本试验的扣瓶频率为1次/12 h。

1.2.3酒母的制备

制曲：使用精米机，将籼米精白，使其精米率在70 %～80 %，采用1.2.2节中制曲工艺，制备（精白）籼米曲和制备籼米曲用。糖化：首先将籼米精掉20 %～30 %，然后淘洗、分装三角瓶、蒸米、冷却后，加入一定量上述制备好的米曲和蒸馏水（饭米∶曲米约为1∶1，总米∶水为1∶1），拌匀，50～60℃糖化12～18 h，再冷却至室温，制得籼米的糖化液。液态试管酵母的制备：试管中加液态马铃薯葡萄糖培养基、121℃高压灭菌20～40 min，冷却至室温，在超净工作台中无菌条件下接种酿酒酵母，28～30℃培养36～48 h。酒母的制备：在超净工作台中无菌条件下将培养好的液态试管酵母振荡均匀后加入制得的糖化液（糖化液量为100 mL/L酿造水）中，再加入乳酸（乳酸的用量为6～7 mL/L酿造水），拌匀，28～30℃培养24 h。

1.2.4 3次喂饭法发酵

第1次喂饭：大米洗净，加一定量的水后分别蒸饭，冷却后于无菌条件下将培养好的酒母、几种大米的米曲和一定量的水加入，拌匀，然后置于18℃下培养50 h。第2次喂饭：大米洗净，加一定量的水后分别蒸饭，冷却后于无菌条件下将其加入发酵罐中，再加入一定量的水和几种大米的米曲，拌匀，然后置于12℃下培养24 h。第3次喂饭：大米洗净，加一定量的水后分别蒸饭，冷却后于无菌条件下将其加入发酵罐中，再加入一定量的水和几种大米的米曲，拌匀。第3次添加完之后，将醪液的发酵温度设定在8～10℃，然后以1℃/d的速率使醪液温度逐步达到15℃。在此之后，将醪液的温度一直保持在15℃左右，直至发酵结束。

1.2.5测定方法

种曲孢子数测定（采用SB/T 10315—1999）：样品稀释→制片→观察计数，孢子数(个/g)=N／80×4×106×n。式中：N为80小格内孢子总数，个；n为稀释倍数。

糖化酶活力测定。待测酶液制备（采用白酒曲中糖化酶浸提法[12]）：称取相当于2 g干曲的米曲，放入100 mL烧杯中，加水（36-2×水分%）mL，缓冲液4 mL，在40℃水浴中浸出1 h，每15 min搅拌1次，干滤纸过滤，弃去最初5 mL，余下澄清滤液备用。测定[13]：采用GB 8276—2006食品添加剂糖化酶制剂中规定的方法对米曲的糖化酶活力进行测定。

液化酶活力测定。待测酶液制备（采用白酒曲中液化酶浸提法）：称取相当于2 g干曲的米曲，放入100 mL烧杯中，加入预热到40℃的缓冲液（10-2×水分%）mL，在40℃水浴中浸出1 h，每隔15 min搅拌1次，干滤纸过滤，弃去最初2 mL，余下澄清滤液备用[12]。测定：采用GB 8275—2009食品添加剂α-淀粉酶制剂中规定的方法对米曲的液化酶活力进行测定[14]。

酸性蛋白酶活力测定。待测酶液制备（采用白酒曲中蛋白酶浸提法[12]）：称取相当于2 g干曲的米曲，放在100 mL烧杯中，加入缓冲液（20-2×水分%）mL，在40℃水浴中浸出30 min，每隔15 min搅拌1次，用干滤纸过滤，最初2 mL滤液不要，余下澄清滤液备用。测定：采用GB/T 23527—2009食品添加剂蛋白酶制剂中规定的方法对米曲的酸性蛋白酶活力进行测定[15]。

酒母理化指标检测。酒母醪液用纱布过滤，测定滤液中酵母数量、出芽率、酸度、还原糖。酵母数：取一定量滤液，稀释一定倍数后，用血球计数板计数。酸度：酵母菌在生长繁殖过程中产生一定量的有机酸，酒母醪中适量的酸度能抑制杂菌的生长，若酸度过大，则说明产酸杂菌污染严重，因此，检测酸度是为了解杂菌污染的程度。还原糖[16]：残还原糖的含量也是判定酒母醪成熟与否的重要依据[15]。

挥发性风味物质测定：萃取条件，在20 mL的顶空瓶中装入约1/2瓶的酒母样品，在50℃平衡2 min，然后于50℃下吸附40 min，进样时，于250℃下解析2 min。气相色谱-质谱条件，起始温度45℃，保持1 min，然后以5℃/min的升温速率升温到190℃，保持15 min，再以10℃/min的升温速率升温到230℃，保持5 min。进样口和检测器温度均为250℃；载气为He，流速为1 mL/min。

2结果与讨论

2.1米曲霉种曲制备

2.1.1米曲霉菌形态学观察

图1米曲霉菌落

图2米曲霉在40倍物镜下的微观形态

米曲霉培养过程菌丝初呈白色，随着生长时间的延长，逐渐有孢子产生，菌落呈现淡黄色，随后转变为黄色，再继续培养，菌落颜色又变为黄绿色。由图1可知，米曲霉菌落外观呈圆形，菌落区域表面覆盖有一层黄绿色的孢子，且菌落中心颜色较菌落边缘颜色更深。由图2可以看出，分生孢子头放射状，顶囊近似球形或烧瓶形，菌丝没有分节。

2.1.2种曲孢子数

制备种曲是制曲的前提，而孢子数是判别种曲质量好坏的一个重要指标。有文献中认为，添加适量的草木灰有助于提高种曲质量，锰对孢子的形成有促进作用[17]。因此为了提高米曲霉种曲的传代性能，在本实验种曲制备过程中加入了1 %的木灰。实验制得的种曲孢子数为9×108个/g。

2.2米曲霉酒曲酶活力

精米——米越白越能酿出好酒，日本清酒生产中，原料米多是采用粳米，用于酿造的米，通常碾去糙米表层，优质清酒几乎是采用“米心”进行酿造。糙米的外层含有大量的蛋白质、灰分、脂肪等。蛋白质可因曲菌的蛋白质分解酶分解成氨基酸，氨基酸可形成清酒呈味的一部分，但如果过多就会产生杂味，还会引起贮藏着色和日光着色；灰分中的铁和锰是与清酒着色有关的物质；脂肪中的脂肪酸与清酒香气成分酯的生成有关[18]。另外，精米处理后的米粒吸水更均匀、更快，蒸饭时易糊化，有助于提高酒的品质。中国黄酒与日本清酒的酿造工艺相似，但黄酒的酿造原料可以采用糯米、粳米和籼米，且酿造米的精米率一般在90 %以上，蛋白质含量较高，为6 %～8 %。本研究中将籼米精米处理，去掉20 %～30 %，使其精米率在70 %～80 %，以提高酒的品质。

表1米曲的酶活力比较

从表1可以看出，（精白）籼米曲的糖化酶活力远远高于籼米曲糖化酶活力，（精白）籼米曲的糖化酶活力达到608.895 U/g。（精白）籼米曲的液化酶的活力也高于籼米曲液化酶活力，达187.08 U/g。（精白）籼米曲的蛋白酶活力为籼米曲的2倍之多，达37.302 U/g。其酶活力高低差异的原因可能与大米的结构有关，米曲霉在利用上存在差异。陈曾三[18]研究指出，米中钾含量和曲中菌体量、酶活性之间有正相关关系，米中钾含量低时制曲酶活性也低。此外，还和米的吸水性及米粒内部组织结构也有重要关系。

2.3酒母理化指标

酒母，即为“酒之母”，它是以大米等淀粉为原料的半液态双边发酵酿酒的基础。只有培养出优良的酒母，才有可能提高酒精发酵率和淀粉利用率[19]，而如何才能培制出高质量的成熟酒母以供发酵用的菌种是解决这一问题的关键。因此，测定和控制酒母醪的质量，对指导生产具有十分重要的意义。

毛青钟等[20]对几种黄酒酒母的特性比较中表明，糖化酒母成熟时其酸度小于等于3.0 g/L，酵母数大于2.0× 108个/ mL，出芽率在20 %以上。刘杰等[21]用响应面法优化黄酒高温糖化酒母的制备工艺中得出，在最佳的物料配比下，其酵母数达到2.37亿/ mL，出芽率达到24.9 %。清酒的高温糖化酒母[22]，使用时其酸度为1.7 mmol/L，还原糖8.9 g/100 mL，酵母数为2.0×108个/g。籼米曲所制备的酒母，其理化指标见表2。

由表2可知，籼米曲制备的酒母，除酸度稍微偏小外、还原糖与酵母数均达到了清酒中高温糖化酒母的理化指标。籼米与（精白）籼米制备的酒母还原糖和酵母数也均达到黄酒中糖化酒母的理化指标要求，出芽率在20 %左右。精白籼米制备的酒母中还原糖含量高于籼米曲制备的酒母中还原糖含量，这一数据间接地证明了（精白）籼米曲的糖化酶活力高于籼米曲的糖化酶活力。

表2米曲制备的酒母的理化指标

2.4酒母挥发性风味物质分析

酒母作为酒精发酵的菌种，其风味对酒的质量有着重要的影响。本实验通过HP-SPME-GC-MS共检出米曲制得酒母中的17种挥发性化合物（见表3）。

表3米曲制得酒母中挥发性物质检测结果

由表3可知，（精白）籼米曲和籼米曲制备的酒母中共检测出17种挥发性化合物，其中主要为醇类和酯类。酯类有14种，它是酒体香味成分中非常重要的一类化合物，由酸和醇在酯化酶的作用下进行酯化反应而产生的，在酒中酯类呈现出水果的香气。籼米曲酒母中挥发性化合物共12种，醇类1种（11.299 %）、酯类10种（65.317 %）、其他（2.772 %）；（精白）籼米曲酒母中共15种，醇类2种（6.292 %），酯类12种（55.417 %），其他1种（1.484 %）。

从检测结果还可知，（精白）籼米曲和籼米曲酒母的挥发性化合物中所共有的物质成分有苯乙醇、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯，这些化合物也是王家林等[23]研究黄酒中风味物质种类时得出的物质，这也说明了酒母风味对酒的特征风味是有一定的贡献的。籼米曲酒母中的苯乙醇含量最高，苯乙醇具有新鲜的面包香、清甜的玫瑰花香，它是稻米类发酵酒的特征性香味物质，新酒中苯乙醇的含量过高时，则会使酒体的苦涩味增强，陈酿有助于苦涩味的下降，使其香味呈现出来。

表4评价标准

2.5酒体感官评价、理化指标及挥发性物质分析

2.5.1酒体感官评价、理化指标

日本清酒色泽淡黄或无色、酒体清亮透明，口味纯正，绵柔爽口，酒体协调，芳香怡人，酒精度为14 %vol～20 %vol。

从表4可以看出，本研究的评价指标共包括1个综合指标和5项指标。其中，5项指标分别指酒精度、色泽、香气、滋味和风格5个方面，而综合指标则是根据5项指标的加权计算结果来确定的。首先，请5位专业品酒人员，通过对比表4中的评价标准为样品的5项指标依次打分，然后计算出5项指标的算数平均值，最后再通过加权计算确定该样品的综合成绩。5项指标的权重是根据特尔菲法[23]来确定的，在本实验中分别为0.3、0.2、0.2、0.2、0.1。

从表5可以看出，籼米清酒酒体协调，有清酒的典型风格。籼米曲与（精白）籼米曲酿制的清酒感官评价得分都相对较低，主要体现在香气不足和滋味欠佳，相比之下，（精白）籼米酿制的酒感官评价得分稍高，距离优质的清酒还有差距，生产工艺仍需改进。

清酒的日本酒度一般在-2～12之间，平均在+4左右，其数值用于清酒甘辛味的参考与判断，度数越高，则酒液越干，反之越甜。日本酒度计是根据清酒比重设计的，比重大则日本酒度低，反之则高。日本酒度计是通用的甜型、干型酒判断仪器[6]。不同大米曲的酒体的理化指标结果见表6。

表5米曲对酒质的影响　　（分）

表6酒体的理化指标

由表6可知，米曲所酿造的酒，其日本酒度均较高，属于偏干型清酒。酒精度在15 %vol左右，总酸含量大于3 g/L，总糖含量大于2 g/L，氨基酸态氮含量大于1 g/L，已达到传统型半干黄酒的优级标准。另外，从表6中还可知，虽然酒精度稍高的是（精白）籼米，但与籼米曲酒差距不大，还原糖仍具有一定含量，若继续延长发酵时间其酒精度会有一定的提高。

2.5.2酒体挥发性物质分析

由表7可以看出，大米曲所酿酒的酒体中挥发性成分共检出18种，醇类、酯类、醛类和其他分别为7种、9种、1种、1种，籼米曲酒体中挥发性化合物共13种，醇类7种（96.45 %）、酯类6种（2.703 %）；（精白）籼米曲酒体中共14种，醇类5种（93.177%）、酯类7种（4.128%）、醛类1种（0.032 %）、其他1种（0.045 %）。

表7籼米曲与（精白）籼米曲所酿酒的挥发性物质比较

另外，从表7还可知，米曲酒体中检出共有的物质包括，乙醇、丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯这9种化合物，而这些物质成分在酒母的挥发性化合物中也有检出，其中苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯也是米曲酒母的挥发性化合物共有成分。（精白）籼米曲酒母的挥发性成分中含有苯甲醛，苯甲醛具有特殊的杏仁气味，它被认定为优质浓香型大曲香味体系的组成部分。

3　结论

采用南方市售籼米制备米曲霉种曲，孢子数量达到实际需求。精制后的籼米适合制备酒曲，糖化酶活力高达608.895 U/g，液化酶活力高达187.08 U/g。利用籼米快速制取酒母，其还原糖含量达到清酒、黄酒中高温糖化酒母的理化指标要求（还原糖8.9 g/100 mL，酵母数2亿个/ mL），精白处理后的籼米其还原糖含量达10.16 g/100 mL，酵母数5.11亿个/ mL。籼米曲酿制的清酒从整体评分来看酒体协调，有清酒的典型风格，但存在香气不足和口感欠佳的问题。以此种籼米曲酿制的清酒酒度达15 %vol左右，其酒体中共检出18种挥发性成分，主要为醇类和酯类物质，其中以异戊醇、苯乙醇和辛酸乙酯的相对百分比含量较高。相比之下，（精白）籼米酿制的清酒感官评价得分稍高，距离优质的清酒还有差距，生产工艺仍需改进。为解决南方市售籼米积压，提升开发籼米的附加值产品，酿制籼米清酒具有一定的实际意义。

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Production of Sake by Indica Rice

WU Hechuan1, LIN Yan1, MAYingying1, ZHOU Jian1, ZHANG Suyi2and YANG Jiangang1,
(1.College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong, Sichuan 643000；2.Luzhou Laojiao Co. Ltd., Luzhou, Sichuan 646000, China)

Abstract:In this study, Sake was produced as follows: indica rice used as raw materials, Aspergillus oryzae used as bacteria strain for Qu-making, and Sake yeast used for starter-making. The experimental results showed that, polished indica rice was especially suitable for Qu-making, with its saccharifying power and liquefying enzyme activity as high as 608.895 U/g and 187.08 U/g respectively. Sake starter was made with polished indica rice as raw materials. As a result, the reducing sugar content (10.16 g/100 mL) and the number of yeast (511 million/mL) of the Sake starter met the requirements of high-temperature saccharifying Sake starter (reducing sugar content=8.9 g/100 mL, and yeast number=200 million/mL). The alcohol content of Sake produced by such indica rice reached up to about 15 %vol, and 18 volatile compounds were detected in Sake body mainly including alcohols and esters (the relative percentage of oamyl alcohol, phenethyl alcohol and ethyl caprylate was comparatively high).

Key words:indica rice; Sake; volatile components;Aspergillus oryzae

通讯作者：杨建刚，教授，E-mail：jgyang29@163.com。

作者简介：吴赫川(1992-)，研究生，研究方向为发酵工程。

收稿日期：2015-07-27

基金项目：四川省科技创新苗子工程（2014093）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015323

中图分类号：TS262.3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）01-0031-06