冯芳萍

(山西省吕梁市离石区农委畜牧兽医技术站，山西 吕梁 033000)

鸡新城疫病毒的分离和鉴定

冯芳萍

(山西省吕梁市离石区农委畜牧兽医技术站，山西 吕梁 033000)

旨在为发病鸡场找到致病原，本研究利用SPF鸡胚从发病鸡组织中分离到1株病毒，病毒对1%鸡红细胞的血凝价为28，病毒的ELD50为107.83/0.1 mL，病毒可以被新城疫病毒阳性血清特异性中和，攻击该病毒的SPF鸡表现出典型的新城疫病毒感染症状，RT-PCR鉴定显示该病毒为新城疫病毒。

鸡新城疫病毒；分离；鉴定

鸡新城疫（Newcastledisease，ND）又称亚洲鸡瘟，是由鸡新城疫病毒（Newcastle diseasevirus，NDV）引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为主要病变特征的急性、败血性、高度接触性传染病[1]。近年来随着我国养禽业的规模化发展，新城疫免疫失败显现不断增加，新城疫成为目前规模养殖场最容易发生的病毒性传染病之一。本研究对临床表现为全身黏膜和浆膜出血、肠道淋巴结肿胀出血、腺胃黏膜水肿、乳头出血、气管有出血和坏死的疑似新城疫病毒感染病例进行病毒的分离与鉴定，为发病鸡场找到致病原和制定综合防治措施提供了参考依据。

1 材料和方法

1.1 鸡胚、鸡、血清

10日龄SPF鸡胚、2月龄SPF鸡均购自济南斯帕法斯家禽有限公司；新城疫病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.2 病料样品的采集与处理

无菌采取病死鸡的气管、淋巴结等组织病料按1：3加入生理盐水，用研磨器反复研磨，12 000 r/min离心10 min，取上清液依次加入终浓度分别为2 000 IU/mL的青霉素、链霉素和卡那霉素，置于4℃放置6 h，即得处理后的病料样品。

1.3 病毒分离传代

将处理后的病料样品接种10日龄SPF鸡胚10枚，0.2 mL/胚，弃去24 h死亡的鸡胚，收集24 h之后死亡的鸡胚尿囊液，传3代，收集每一代的死亡鸡胚尿囊液，取第3代病毒尿囊液做下面的毒株鉴定。

1.4 分离毒株血凝性测定

按照常规血凝实验方法测定第3代分离毒对1%鸡红细胞的凝集性。

1.5 分离毒株鸡胚半数致死量（ELD50）的测定

将第3代病毒尿囊液做10倍系列稀释，取10-6，10-7，10-8三个稀释度分别接10日龄SPF鸡胚5枚，弃去24h死亡的鸡胚，记录接种后24 h死亡且胎儿病痕明显的鸡胚，按Reed-Muench法计算ELD50。

1.6 中和试验

将第3代病毒尿囊液与等量新城疫病毒阳性血清混合，室温中和1 h后，接种10日龄SPF鸡胚10枚，0.2 mL/胚，弃去24 h死亡的鸡胚，观察鸡胚死亡情况，至120 h，取所有活胚尿囊液做凝集实验。

1.7 动物回归试验

将分离的第3代病毒接种健康2月龄SPF鸡10只，每只鸡气管内注射0.1mL，观察接种后鸡的发病情况。

1.8 RT-PCR鉴定

将分离的第3代病毒按照参考文献[3]的方法提取病毒基因组RNA，并按照文献[2]中的RT-PCR反应程序进行PCR扩增，RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2 结果与分析

2.1 病毒分离与胚体病变观察结果

鸡胚接种病料样品后48 h开始出现死亡，一般在72～96 h死亡较多，取死亡鸡胚剖检可见全身有出血点，鸡胚缩小，发育不良。

2.2 血凝性的测定结果

通过血凝实验，测定第3代分离毒的血凝价为28。

2.3 ELD50的测定结果

第3代分离毒的ELD50为107.83/0.1 mL。

2.4 中和试验结果

第3代分离毒与新城疫阳性血清中和后，接种10日龄SPF鸡胚10枚全部健活，活胚尿囊液对1%鸡红细胞无凝集性，说明分离毒株可以被新城疫病毒阳性血清特异性中和。

2.5 动物回归试验结果

第3代分离毒接种健康SPF鸡后，接种第3 d开始发病，发病鸡食欲下降，精神萎靡，翅下垂，眼半闭半睁，后期出现咳嗽和呼吸困难，5 d后全部死亡。剖检死亡鸡可见全身出血，消化道和呼吸道出血明显。

2.6 RT-PCR鉴定结果

PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳，在511 bp处出现特异性扩增条带，与预期大小一致，说明扩增产物为新城疫病毒的特异性序列，分离毒株为新城疫病毒。

3 讨论

本研究通过对现地感染的病鸡病变组织处理后接种10日龄SPF鸡胚，通过对分离毒进行血凝性，中和试验，ELD50测定和动物回归试验及RT-PCR检测，最终确定鸡场感染新城疫病毒，为发病鸡场找到致病原及综合防制奠定了基础。新城疫病毒是家禽最常见的病毒性传染病，各种家禽普遍易感，各种年龄鸡都可感染，幼鸡和雏鸡更易感。本病春秋两季高发，鸡群一旦发生强毒感染，一般很难净化。新城疫的防治主要通过疫苗免疫接种，制定科学合理的免疫程序对新城疫的防控至关重要。免疫鸡群也可以发生新城疫病毒感染，往往由于母源抗体干扰免疫效果导致免疫失败[3]，因此，新城疫疫苗免疫要掌握好免疫时机，避开母源抗体高峰期，一般可以对鸡群的母源抗体效价进行监测，如果抗体效价高于25则不产生免疫应答，在23的时候免疫接种可以产生良好的免疫效果。平时需要做好养殖场的环境卫生，保持鸡舍的温度，通风良好，一旦发生患病鸡要及时隔离。此外，防治新城疫要采取严格的生物安全措施，加强引种方面的监管，防止新城疫强毒进入家禽群，做好定期的免疫接种工作，提高禽群特异性免疫效果。

[1]肖华平,黄忍,魏培,等.新城疫病毒的最新研究进展[J].中国畜牧兽医文摘，2016，32(4)：43，87.

[2]梁瑾,程福亮,陈甜甜,等.新城疫病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国生物制品学杂志, 2013,26（2）：265-267.

[3]刘孝霖,马金松,刘学洪.鸡新城疫免疫失败的原因及对策[J].当代畜牧,2016（1）：8-9.

(编辑：张淑凤)

S852.659.5

B

1006-799X(2016)21-0095-01

冯芳萍（1968-），女，山西吕梁人，兽医师，主要研究方向为畜牧兽医。