向银洲，顾昱，彭平，许军，宁娜

(三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000)

塞来昔布联合吡咯烷二硫氨基甲酸对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z生长的影响

向银洲，顾昱，彭平，许军，宁娜

(三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000)

目的探讨塞来昔布与吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)联合应用对人鼻咽癌CNE-2Z细胞株生长的影响及其可能机制。方法实验分为对照组(不含任何药物)、塞来昔布组(含塞来昔布50 μmol/L)、PDTC(含PDTC 50 μmol/L)组和塞来昔布+PDTC(含塞来昔布、PDTC均为25 μmol/L)组。细胞抑制率以四甲基偶氮唑蓝实验方法检测；CNE-2Z细胞周期以流式细胞仪检测；用免疫细胞化学染色法检测核因子(NF)-κB和环氧合酶(COX)-2蛋白的表达；用Western-blot方法检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白表达。结果塞来昔布、PDTC单独作用及塞来昔布+PDTC联合作用于鼻咽癌CNE-2Z细胞24 h、48 h、72 h细胞的生长均受到抑制(P＜0.05)，二药联合组与单独用药组比较，细胞的生长抑制率差异有统计学意义(P＜0.05)。塞来昔布+PDTC联合用药作用于细胞48 h后G0/G1期细胞比例明显高于塞来昔布组和PDTC组，抑制效果更显著(P＜0.05)。免疫细胞化学染色显示塞来昔布+PDTC组NF-κB、COX-2的表达明显低于单独用药组(P＜0.05)。Western-blot实验示联合用药组Caspase-3蛋白表达高于单独用药组(P＜0.05)。结论Cox-2抑制剂塞来昔布联合PDTC能够显著抑制人鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖，其机制可能是通过降低COX-2、NF-κB表达，增强Caspase-3蛋白表达来实现。

塞来昔布；吡咯烷二硫氨基甲酸；人鼻咽癌细胞株；抑制作用

鼻咽癌是华南地区耳鼻咽喉科常见的恶性肿瘤之一，其发病原因与与多种因素相关，如遗传易感性、病毒感染、化学致癌物等。鼻咽癌早期患者3年生存率约为90%，5年生存率徘徊在78%；晚期患者5年生存率更不乐观，约40%，多数患者死于肿瘤的复发和远处转移[1]。因此从分子水平探索预防、治疗鼻咽癌的措施很有必要，本研究探讨了环氧合酶抑制剂塞来昔布联合核因子(NF)-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对鼻咽癌CNE-2Z细胞生长增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料第三军医大学肿瘤研究所惠赠人鼻咽癌细胞株CNE-2Z；吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI，美国Sigma公司)；塞来昔布分析纯(美国辉瑞公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT，上海生物工程公司)；RPMI-1640(美国Hyclone公司)；乙二胺四乙酸(DAB)染色盒、鼠抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、鼠抗人COX-2单克隆抗体、SP-9000免疫组化盒(北京中杉金桥生物公司)；新生牛血清、胰酶(杭州四季青公司)；总RNA提取试剂Trizol(武汉谷歌生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 CNE-2Z细胞培养复苏人鼻咽癌CNE-2Z细胞，接种于100 ml培养瓶中，加入含10%灭活胎牛血清、100 U/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640培养液，放置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。常规更换培养液，进行正常传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定CNE-2Z细胞生长的抑制率取处于对数生长期的CNE-2Z细胞进行实验，0.25%胰蛋白酶消化细胞，调整细胞悬液浓度为5×104/ml，按每孔200 μl接种于96孔板上。细胞贴壁后分为塞来昔布组(50 μmol/L)、PDTC组(50 μmol/L)、塞来昔布(25 μmol/L)+PDTC组(25 μmol/L)，同时设立空白对照组(只加培养基)。每个浓度5个复孔，重复3板，分别在培养24 h、48 h及72 h后除去培养液，每孔加入200 μl无血清培养液和20 μl MTT(50 mg/m1)，继续培养4 h后弃培养液，每孔加入200 μl二甲基亚砜，振荡10 min，用酶标仪测定570 nm波长处吸光度(A)值。参照文献[2]计算细胞抑制率。细胞抑制率(0A)=(1-实验组A值/细胞对照组A值)×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测CNE-2Z细胞周期选取对数生长期CNE-2Z细胞，调整细胞浓度为1.0×105/ml，将细胞接种至100 ml培养瓶中，加入适量含10%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养液，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养24 h，待细胞生长至70%～80%融合时，分对照组(不加任何药物)、塞来昔布组(50 μmol/L)、PDTC组(50 μmol/L)和塞来昔布+PDTC(25/25 μmol/L)4组。培养48 h后除去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备成细胞悬液，70%预冷(-20℃)乙醇固定，过夜。吸去乙醇，PBS冲洗3次，调整细胞浓度为1×106/ml，加入RNase酶(20 μg/ml)200 μl消化30 min，加入1 ml碘化丙啶(20 μg/ml)，于室温遮光染色30 min，上流式细胞仪检测，每组重复3次，Cell Quest及Modifit软件分析细胞周期分布。

1.2.4 免疫细胞化学染色检测NF-κB、COX-2蛋白表达选取对数生长期CNE-2Z细胞，制成5×104/ml浓度细胞悬液，接种于预置盖玻片的6孔板中，每孔2 ml，放入37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养24 h，贴壁后分四组，分别为对照组(不加任何药物)、塞来昔布组(50 μmol/L)、PDTC(50 μmol/L)组和塞来昔布(25 μmol/L)+ PDTC(25 μmol/L)组。培养24 h，更换无药培养液培养24 h后除去培养液，PBS洗涤3次，95%的乙醇室温固定30 min后，PBS洗涤3次，取出盖玻片，常规SP法免疫化学染色，DAB显色，晾干封片后光镜下观察。CNE-2Z细胞中NF-κB阳性表达标准为细胞浆和细胞核中可见棕黄色颗粒；COX-2阳性表达标准为为细胞浆可见棕黄色颗粒。HSCORE评分：排除爬片边缘细胞，在低倍镜下随机选取细胞分布均匀的视野10个，然后在高倍镜下每个视野随机选50个细胞，根据细胞浆或核着色深浅进行NF-κB、COX-2蛋白表达评分：(1)阴性：0分，不着色；(2)弱阳性：1分，淡黄色；(3)阳性：2分，黄色；(4)强阳性：3分，深棕色。根据公式HSCORE=ΣPi(i+1)(i=0，1，2，3；Pi表示评分为i的比例)计算细胞HSCORE得分[3]。

1.2.5 Western blot检测Caspase-3蛋白表达细胞浓度调为1.0×104ml，接种于100 ml培养瓶中，加入适量培养基，细胞贴壁后分四组，分为对照组(不加任何药物)、塞来昔布组(50 μmol/L)、PDTC(50 μmol/L)组和塞来昔布(25 μmol/L)+PDTC(25 μmol/L)组。培养24 h，均更换无药培养液培养24 h，吸去培养液，PBS洗涤3次，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，转移至离心管中，加入蛋白质裂解液100 μl，在冰浴条件下静置裂解30 min，上离心机离心5 min后收集上清液，用考马斯兰亮法定量，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，4℃封闭过夜。将硝酸纤维素膜放人含一抗Caspase-3抗体的封闭液中，4℃过夜，电转液洗3次，每次10 min。放人含辣根酶标记的相应IgG二抗抗体的封闭液中，室温2 h，电转液洗3次，每次10 min。将膜放在保鲜膜上，检测Caspase-3蛋白的表达，并用Quantity One分析软件进行灰度值测定。

2 结果

2.1 MTT检测药物对CNE-2Z鼻咽癌细胞的生长抑制率的影响塞来昔布+PDTC组对鼻咽癌CNE-2Z细胞的生长抑制作用强于塞来昔布组、PDTC组对鼻咽癌CNE-2Z细胞的生长抑制作用，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组药物不同时间对鼻咽癌细胞的生长抑制率(n=5，%，±s)

表1 各组药物不同时间对鼻咽癌细胞的生长抑制率(n=5，%，±s)

别24 h 48 h 72 h塞来昔布组TC组来昔布+PDTC组值30.21±6.42 35.78±6.33 51.20±3.12 19.48 4472 PD塞F P值＜0.05 7.35±7.11 4.56±6.47 0.34±4.68 6.26＜0.05 52.64±5.97 50.63±5.52 88.32±3.89 81.89＜0.05

2.2 流式细胞仪检测细胞周期分布塞来昔布组、PDTC组及塞来昔布+PDTC组分别作用48 h后，CNE-2Z细胞的细胞周期分布见表2。塞来昔布+ PDTC组G0/G1期细胞比例明显增高，细胞呈现G0/G1期阻滞，抑制效果更显著，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 流式细胞仪检测CNE-2Z细胞周期的变化(n=3，%，±s)

表2 流式细胞仪检测CNE-2Z细胞周期的变化(n=3，%，±s)

组别G0/G1期S期G2/M期对照组塞来昔布组PDTC组塞来昔布+PDTC组F值P值66.84±5.21 81.66±7.80 80.54±5.14 92.52±4.68 9.75＜0.05 21.11±2.21 8.72±1.22 9.87±2.13 4.39±1.92 41.76＜0.05 12.05±1.73 9.62±1.06 9.59±1.44 3.09±1.18 23.36＜0.05

2.3 免疫细胞化学检测NF-κB和COX-2蛋白的表达NF-κB和COX-2在各组CNE-2Z细胞表达呈阳性，分别在细胞核和细胞浆有黄色颗粒。与对照组、塞来昔布组、PDTC组比较，塞来昔布+PDTC组NF-κB、COX-2的表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。各组免疫组化染色评分见表3。

表3 各组细胞中NF-κB、COX-2免疫组化染色和组织学评分(分，±s，n=12)

表3 各组细胞中NF-κB、COX-2免疫组化染色和组织学评分(分，±s，n=12)

组别NF-κB COX-2对照组塞来昔布组PDTC组塞来昔布+PDTC组F值P值2.76±0.53 2.13±0.46 1.86±0.35 1.08±0.31 32.70＜0.05 2.56±0.43 1.55±0.29 1.97±0.32 1.17±0.28 37.89＜0.05

2.4 Western blot法检测Caspase-3蛋白的表达塞来昔布组、PDTC组和塞来昔布+PDTC组与对照组比较，Caspase蛋白表达增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；塞来昔布+PDTC组与单独用药组比较，Caspase-3表达增高更显著，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 各组细胞Caspase-3的表达注：1～4泳道分别为对照组、塞来昔布组、PDTC组和塞来昔布+PDTC组。

3 讨论

鼻咽癌的发生、发展、转移与多种细胞因子相关，如COX-2、NF-κB等在鼻咽癌细胞中的表达与细胞的生长增殖及凋亡等均有相关性[4-5]。本实验采用塞来昔布与PDTC联合作用于鼻咽癌CNE-2Z细胞，与单用一药比较，其抑制生长增殖作用更显著。NF-κB具有抑制细胞凋亡和参与调控细胞周期的双重功效，其抑制细胞凋亡可能是通过诱导阻止凋亡进程的基因表达来实现，包括Bcl-2家族的成员、细胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族等[6]。有研究在22只人乳腺导管癌裸鼠的肿瘤组织中检测NF-κB、Caspas-3的表达，结果显示NF-κB与Caspas-3蛋白表达呈负相关。其机制可能是各种凋亡相关因子作用于Caspas-3的前体，使前体转化为有活性的Caspase-3，激活了DNA酶，导致细胞核内染色体聚集、断裂或细胞骨架降解，从而引起细胞凋亡[7]。

本实验结果显示塞来昔布、PDTC单独应用可以抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的生长增殖，表现为CNE-2Z细胞G0/G1期细胞增多，S期及G2/M期细胞减少，CNE-2Z细胞生长过程明显受阻于G0/G1期。塞来昔布与PDTC联合应用后细胞生长过程受阻于G0/G1期更显著。免疫细胞化学染色实验中，Cox-2、NF-κB表达阳性，二药联用比单独应用一种药物其表达降低更明显。从蛋白水平分析，二药联用后Caspase-3表达升高，可能是通过Cox-2、NF-κB途径抑制了鼻咽癌细胞的生长增殖，促进了细胞凋亡[8]。NF-κB是一种重要的多功能核转录因子，是由p65和p50构成的杂二聚体，参与真核细胞凋亡相关基因的转录与表达，其抑制细胞凋亡的作用可能与凋亡相关抑制蛋白家族中某些成员有关，抑制NF-κB活性可以诱导家族中某些因子的表达变化，从而促进Caspase-3表达，发挥抗凋亡作用[9]。

本实验提示Cox-2抑制剂塞来昔布联合NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z生长增殖有抑制作用，其协同促进人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡机制有待进一步研究。随着更多相关实验的进行，塞来昔布、PDTC的作用机制会更加明确，它们将成为很有前景的抗肿瘤药物。

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Effects of celecoxib combined with pyrrolidine dithiocarbamate on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Zcell lines.

XIANG Yin-zhou,GU Yu,PENG Ping,XU Jun,NING Na.Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Three Gorges University,the First People's Hospital of Yichang

ObjectiveTo study the sound effects of celecoxib combined with pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)on the growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cell lines and the possible mechanisms.MethodsThe experiment enrolled 4 groups:control group(without drug),celecoxib group(celecoxib 50 μmol/L),PDTC group(PDTC 50 μmol/L)and celecoxib+PDTC group(celecoxib 25 μmol/L+PDTC 25 μmol/L). The inhibition rate of cell growth was detected by four methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric(MTT)method.The tumor cell cycle was analyzed by flow cytometry.The expressions of nuclear factor kappa B(NF-κB)and cyclooxygenase (COX)-2 were examined by immunocytochemistry method.The expression of cysteinyl aspartate specific proteinase (caspase)-3 was tested by Western blot.ResultsThe proliferation activity of nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells with celecoxib,PDTC,celecoxib+PDTC processing(24 h,48 h and 72 h)all were inhibited significantly(P＜0.05).Compared to PDTC group and celecoxib group,the inhibition rate of celecoxib+PDTC group showed significant difference (P＜0.05).Treated by Celecoxib and PDTC for 48 h,cell cycle was prevented in G0/G1phase.Cell percentage in G0/G1phase was significantly higher than that of celecoxib group and PDTC group(P＜0.05).The result of immunocytochemical staining indicated that the expressions of NF-κB and COX-2 in celecoxib+PDTC group were significantly lower than that of celecoxib group and PDTC group(P＜0.05),and Western blot indicated that the expression of caspase-3 in celecoxib+PDTC group was significantly higher(P＜0.05).ConclusionCOX-2 inhibitor celecoxib combined with PDTC can inhibit the proliferation of CNE-2Z cell lines.Its possible mechanism is to decrease the expressions of COX-2 and NF-κB,and enhance the expression of caspase-3 protein.

Celecoxib;Pyrrolidine dithiocarbamate;Human nasopharyngeal carcinoma cell line;Inhibition

R739.63

A

1003—6350（2016）01—0007—03

2015-07-13)

湖北省宜昌市科技局基金资助项目(编号：A14301-16)

向银洲。E-mail：2402342279@qq.com