陈凯凯,郭和清,穆大为,李建业,严景民,尹杏林,张立铭



·论著·

模拟加速度对肾草酸钙结石模型大鼠氧化应激的影响

陈凯凯,郭和清,穆大为,李建业,严景民,尹杏林,张立铭

[摘要]目的探讨加速度暴露对肾草酸钙结石模型大鼠氧化应激的影响。方法采用乙二醇饮水和氯化铵灌胃法诱导建立大鼠草酸钙结石模型，将40只8周龄Wistar健康雄性大鼠随机分为4组(每组10只)：空白对照组(A组)、单纯诱石组(B组)、加速度并诱石组(C组)和单纯加速度组(D组)。其中A组采用自来水饮水+生理盐水2 mL/d灌胃，B组采用1%乙二醇+2%氯化铵溶液2 mL/d灌胃，C组在B组的基础上给予加速度(+6G)暴露，D组单纯给予+6G暴露。各组大鼠在相同条件下饲养28 d后收集血液及双肾标本，左肾组织做石蜡切片HE染色，光镜下观察草酸钙结晶情况；右肾组织制成组织匀浆，测定血液和右肾组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原性谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量，以了解氧化应激情况。结果单纯诱石组和加速度并诱石组肾组织草酸钙结晶评分较空白对照组和单纯加速度组均显著增高(P<0.01)，加速度并诱石组结晶评分亦较单纯诱石组增高(P<0.01)。单纯诱石组和加速度并诱石组与空白对照组比较，大鼠血、肾组织MDA浓度显著升高(P<0.01)，血、肾组织SOD、CAT、GSH-Px浓度显著降低(P<0.01)。结论加速度暴露可能是泌尿系结石形成的危险因素之一，其机制可能与加速度暴露引起大鼠肾脏组织氧化应激损伤有关。

[关键词]肾结石；草酸钙；加速度；氧化应激；大鼠

作者单位：100142北京，北京空军总医院泌尿外科

引用格式：陈凯凯,郭和清,穆大为,等.模拟加速度对肾草酸钙结石模型大鼠氧化应激的影响[J].东南国防医药，2016,18(1):10-12，31.

泌尿系结石是飞行人员常见疾病，病因复杂，绝大多数患者无明显解剖及生理异常，主要表现为上尿路结石，患病率达2.6%~7.8%[1]。在因泌尿系统疾病住院的飞行员中，泌尿系结石所占比例高达70%左右[2]。主要原因考虑与患者饮食结构和自身职业特点有关，如长期摄入高蛋白、高嘌呤、高蔗糖及高钙膳食，长时间飞行时出汗，尿中结晶盐经常处于过饱和状态，均可促进泌尿系结石的形成[3-4]。有研究证实加速度暴露可诱导氧化应激从而引起肾小管上皮细胞氧化损伤[5]，而肾小管上皮细胞损伤是肾结石发生发展的重要环节[6]，但是关于加速度暴露是否是肾结石形成的危险因素，国内研究较少，本实验拟通过研究加速度对大鼠氧化应激及肾草酸钙结石形成的影响，为临床防治飞行员泌尿系结石提供理论探讨。

1材料与方法

1.1实验材料SPF级健康成年雄性Wister大鼠40只，体重180～220 g，由解放军304医院实验动物中心提供[批准文号：SYXK(军)2012-0014；合格证号：No.11401500002634]；小动物专用离心机(长春奥普光电公司，中国)由航空医学研究所提供；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；1%乙二醇、2%氯化铵(生产批号：130105)购自西陇化学股份有限公司。

1.2实验方法本实验经院动物伦理委员会批准，大鼠的使用符合动物保护相关伦理条例。所有大鼠自由摄取食物、水，在25 ℃空调恒温、12 h白昼循环环境下适应性饲养1周后，按随机分组法分为4组，每组10只，从第2周开始施加不同干预因素继续饲养4周。参考文献[7]复制肾草酸钙结石模型：空白对照组(A组)，自来水饮水+生理盐水2 mL/d灌胃；单纯诱石组(B组)，1%乙二醇+2%氯化铵2 mL/d灌胃；加速度并诱石组(C组)，在B组的基础上给予加速度干预，使用小动物离心机在加速度(+6G)下暴露1 min，5次/d，每次中间休息5 min，每周3次，共4周；单纯加速度组(D组)，自来水饮水+生理盐水2 mL/d灌胃，加速度干预同C组。

1.3观测指标实验进行至第4周末，断颈处死大鼠，下腔静脉穿刺取血，迅速取出双肾。右肾使用组织匀浆器制成10%组织匀浆待测氧化应激指标；左肾用4%甲醛固定，石蜡切片，常规苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肾组织草酸钙结晶及病理改变情况。光镜观察左肾常规切片成石情况根据结晶的分布区域及结晶形成程度的双重因素进行评分[8]。结晶情况以积分值来评价，积分值[8]由结晶分布区域的分值与结晶形成程度的分值相乘得到，即：结晶分布区域以肾皮质内结晶为1分，肾皮质及肾髓质内结晶为2分，肾皮质、肾髓质、肾乳头内均有结晶为3分，肾皮质、肾髓质、肾乳头及肾盂内均有结晶为4分；结晶形成程度以无为0分，极少为1分，较多为2分，广泛形成为3分。

按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书，测定肾组织匀浆中MDA、SOD、GSH、GSH-Px及CAT含量。

2结果

2.1各组大鼠肾组织切片草酸钙结晶情况A组:肾组织无结晶形成，肾乳头、肾盂、肾盏结构清晰，细胞排列整齐、规则，肾小管腔内无坏死脱落样物质；B组:肾组织部分可见皮质或及髓质或及肾乳头少量或较多结晶，形状不规则、折光性较强，少量炎细胞浸润，上皮细胞有时可见肿胀，间质有少量水肿；C组大鼠: 肾组织皮质、髓质、肾乳头皆可见大量无色透明草酸钙结晶形成，大部分肾组织切片内可见结石结晶，切片各部分均可见大量炎细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀；D组大鼠：肾组织无结晶形成，肾乳头、肾盂、肾盏结构清晰，肾小球形状较规则，少量炎细胞浸润，肾小管有时可见扩张，上皮细胞有时可见肿胀，间质有少量水肿(图1)。B组、C组肾组织草酸钙结晶评分(分别为7.1±2.9、10.3±3.6)比A组、D组(均为0±0)显著增高(P<0.01)，C组结晶评分亦较B组显著升高(P<0.01)。

2.2各组大鼠血、肾组织匀浆MDA等的比较与A组比较，B、C、D组大鼠血、肾组织MDA浓度显著增加(表1，P<0.01)，加速度干预(C、D组)可增加血、肾组织MDA。与A组比较，B、C、D组大鼠血、肾组织SOD、GSH-Px、CAT浓度显著降低(P<0.01)，且C组0.05)。

3讨论

图1　光镜下各组大鼠肾组织草酸钙结晶(箭头所示)情况 (HE ×400)

表1　各组大鼠血、肾匀浆组织MDA和SOD等的比较±s)

项目A组(n=10)B组(n=10)C组(n=10)D组(n=10)血MDA(nmol/mL)20.35±2.3536.92±3.23#43.22±3.52#27.95±1.87#肾匀浆MDA(nmol/mgpr)8.67±0.8412.43±0.96#15.33±0.71#10.63±0.79#血SOD(U/mL)115.45±18.3775.99±15.55#53.67±12.35#93.98±17.35#肾匀浆SOD(U/mgpr)324.36±26.67198.71±32.32#116.85±18.25#246.11±26.58#血CAT(U/mL)6.64±0.694.32±0.46#3.32±0.41#5.38±0.62#肾匀浆CAT(U/mgpr)138.47±8.74129.87±9.55#118.95±6.35#133.49±7.45#血GSH-Px(U/mL)26.84±2.8621.06±3.61#15.33±4.56#24.73±3.54#肾匀浆GSH-Px(U/mLpr)46.28±3.4733.63±4.63#37.62±2.97#38.94±3.99#血GSH(nmol/mL)38.98±4.5526.87±3.92#23.72±3.24#25.33±2.53#肾匀浆GSH(nmol/mLpr)122.33±12.5489.72±9.93#83.95±8.54#88.81±9.33# 注:与A组比较,﹟P<0.01

为研究加速度暴露因素对大鼠肾草酸钙结石的影响及其发生机制，我们采用乙二醇饮水和氯化铵灌胃法诱导建立了大鼠肾草酸钙结石模型[7]。乙二醇是草酸代谢的间接前体，在体内经过羟乙酸途径代谢产生草酸，是目前复制肾草酸钙模型最常用的基础诱石剂，常与肾毒性药物氯化铵联用加快肾结石的形成，提高造模成功率。本实验中大鼠饮用1%乙二醇溶液和2%氯化铵溶液灌胃后肾小管内出现了结石结晶，说明造模成功，与国内外有关作者[7-8]报道一致。其中C组草酸钙结晶评分高于B组，说明大鼠暴露于加速度下促进了肾小管内草酸钙结晶量的增加。

加速度暴露促进肾结石的形成可能与肾脏氧化应激损伤有关。正常情况下，机体存在着氧自由基的产生与清除酶系统之间的动态平衡，一旦这种平衡遭到破坏即可造成细胞的损伤而致病。氧自由基不仅能直接损伤肾小管上皮细胞，还能引起脂质过氧化产物的增多，导致机体内氧化与抗氧化系统失衡，继而在各种大分子的作用下触发级联反应促进肾结石的最终形成[9]。Khan等[10]研究认为肾小管管腔壁可能是草酸钙结石最初成核部位，草酸钙结晶体附着并生长依赖于肾小管上皮细胞的损伤。草酸钙会刺激肾小管上皮细胞产生活性氧簇ROS引起氧化应激反应，导致上皮细胞自身损伤进而产生带负电荷的物质如磷脂酰丝氨酸等并成为附着点，草酸钙即以此为中心进行黏附并生长[11]。肾小管上皮细胞损伤后还可以导致其能够抑制晶体结晶过程的物质生成减少，从而有利于肾结石的形成。

持续性加速度作用是航空航天飞行活动中的常见现象，随着新型战斗机的大量服役，这一问题将更加突出。在加速度作用下，随着流体静压梯度的增加，器官的动脉血压降低，血流量下降到临界值以下时，组织发生急性缺血缺氧[12]，血液转移及血液动力学改变所引起的机体变化类似“缺血再灌注”的影响。组织缺血再灌注以及强烈的应激反应等均可引起机体氧自由基代谢异常[13]，从而引起肾结石的发生发展。MDA水平可反映机体内脂质过氧化的程度，而SOD是在机体活性氧清除反应过程中发挥重要作用的抗氧化酶[14]。本实验大鼠暴露于加速度后，血和肾组织MDA较对照组显著升高(P<0.01),血、肾组织SOD、GSH-Px、CAT浓度显著降低(P<0.01)，验证了加速度暴露不仅能直接导致氧自由基的产生，还能降低肾脏的SOD和CAT的活性，从而升高肾组织中氧自由基的水平，显著增加的氧自由基具有直接的细胞毒性而致肾损伤，并促进肾结石的发生及发展

综上所述，加速度暴露会促进肾小管内草酸结晶量的增加，其机制可能与加速度作用引起肾脏氧化应激损伤有关，建议临床上对暴露于持续性加速度的飞行人员采取相关防护措施。以上结论是在大鼠实验结果基础上的推测，飞行人员经受加速度暴露环境后，相关指标变化趋势是否与实验结果一致，还应进行进一步研究证实。

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(本文编辑：张仲书；英文编辑：王建东)

Effect of acceleration on oxidative stress of renal calcium oxalate rat models

CHENKai-kai,GUOHe-qing,MUDa-wei

,LIJian-ye,YANJing-min,YINXing-lin,ZHANGLi-ming.DepartmentofUrology,AirForcePLAGeneralHospital,Beijing100142,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of accelerationon on oxidative stress of renal calcium oxalate (CaOx) rat models. MethodsThe models of renal CaOx were established with Ethylene Glycol(EG) in drinking water and Ammonium Chloride(AC) by gavage. A total of 40 adult healthy male Wistar rats were randomly and averagely divided into 4 groups(10 of each): blank control group(A), stone forming group(B), stone forming with +6G exposure group(C) and +6G exposure naive group(D). Group A was established with drinking water and physiological saline by gavage (2 mL per day). Group B was established with 1% ethylene glycol in drinking water and 2% ammonium chloride by garage(2 mL per day). Group C, with the foundation of group B, was exposed in+6G. Group D was exposed in +6G as same as group C. After feeding for 28 days, blood and renal samples were collected. The presence of CaOx crystals was scored in left renals under hematoxylin and eosin staining, and the level of malonddialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione (GSH) and glutathione Peroxidase (GSH) in the blood and right renal homogenate were measured as indicators of oxidative stress. ResultsFor the formation of CaOx crystals, the score of group B and group C were significantly higher than group A and group D(P<0.01), and the score of group C were significantly higher than group B(P<0.01). For the parameter of oxidative stress, compared with group A, the concentration of MDA in blood and kidney tissues of group B significantly increased (P<0.01),which significantly increased (P<0.01) after the intervention of +6G (group C). Compared with group A, the content of SOD, CAT and GSH-Px in blood and kidney tissues of group B significantly decreased (P<0.01), which significantly increased (P<0.01) after the intervention of +6G (group C). ConclusionAcceleration would be one of the risk factor contributed to kidney stone formation. The mechanism is connected with the oxidative damage of renal tissue．

[Key words]kidney calculi; calciumoxalate; acceleration; oxidative stress; rats

(收稿日期：2015-10-18；修回日期：2015-11-22)

通讯作者：郭和清，E-mail：guoheqing@sina.com

基金项目：全军后勤科研“十二五”重大项目(AKJ11J004)

[中图分类号]R852

[文献标志码]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.003