张银玲，薛　赓，孙树汉,张　毅



·论著·

应用RNA-Seq技术筛选不同浓度叶酸培养的QSG-7701细胞中的差异表达基因

张银玲，薛赓，孙树汉,张毅

[摘要]目的在验证不同浓度叶酸培养影响人正常肝细胞系增殖、周期和迁移能力的基础上，应用转录组测序(RNA-Seq)技术筛选差异表达基因，为进一步探讨叶酸缺乏与基因差异表达以及正常肝细胞恶性转化之间的相关性打下基础。方法不同浓度叶酸培养(无叶酸组0 mg/L，正常叶酸组40 mg/L)的人正常肝细胞系QSG-7701 6个月，应用CCK-8实验检测细胞增殖、流式细胞技术检测细胞周期、细胞凋亡、Transwell小室检测细胞迁移；利用RNA-Seq技术对两组细胞中的mRNA进行检测，筛选差异mRNA；通过用实时定量PCR对RNA-Seq的结果进行验证，并结合统计学和生物信息学方法分析差异mRNA。结果无叶酸培养显著提高QSG-7701细胞的增殖能力，促进细胞由静止期进入分裂期，促进细胞的迁移能力；RNA-Seq检测得到含有16 774条差异mRNA的数据集，初步分析显示其中391条差异mRNA可能与不同浓度叶酸培养相关，其中上调的115条，下调的276条；随机对其中11条进行实时定量PCR验证，72.73%的结果与RNA-Seq一致；分析显示，差异mRNA相对应的基因与细胞周期等生理过程以及多种肿瘤的发生、发展密切相关。结论最终筛选出参与叶酸调控正常肝细胞恶性转化相关的基因，RNA-Seq技术能有效地用于差异基因地筛选。

[关键词]叶酸；QSG-7701细胞；转录组测序技术；基因表达

作者单位：200433上海，第二军医大学医学遗传学教研室(张银玲和薛赓为共同第一作者)

引用格式：张银玲，薛赓，孙树汉,等.应用RNA-Seq技术筛选不同浓度叶酸培养的QSG-7701细胞中的差异表达基因[J].东南国防医药，2016,18(1):1-5，16.

叶酸(Folate，FA)是水溶性B族维生素，因在绿叶蔬菜中含量丰富而得名。叶酸参与了人体众多重要物质的合成和代谢，尤其是DNA的合成和甲基化修饰，然而人体自身只能合成少量叶酸，各种生理过程中所需要的叶酸主要由食物中摄取。近年来大量的流行病学调查资料及动物模型实验皆表明，叶酸缺乏可与包括胰腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌[1-4]等多种肿瘤的发生密切相关,研究显示，在肿瘤发生的早期，叶酸通过调控DNA甲基化等表观遗传修饰进而影响肿瘤相关基因的表达，但是究竟哪些基因能够受叶酸调控，参与肿瘤的早期发生目前尚有待于研究。

为此我们选择利用目前较为流行且比较成熟的转录组测序(RNA-Seq)技术对不同浓度叶酸培养的人正常肝细胞系QSG-7701中的差异表达基因进行高通量检测。RNA-Seq技术，是近年发展起来的利用深度测序进行转录组分析的技术[5]。基于illumina HIS 2500高通量测序平台的转录组测序技术能够在单核苷酸水平上对任一物种特定器官或组织在任一状态下的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和基因表达水平的同时，还能发现未知的低峰度的新转录本，精确识别可变剪切位点，非编码区域功能研究等，提供全面的转录组信息。与传统的表达谱芯片技术相比，转录组测序可以对任意物种的转录活动进行检测，不需要预先针对已知序列设计探针，并且提供精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，优势明显。通过RNA-Seq检测，我们对比、分析了不同浓度叶酸培养的QSG-7701细胞中的mRNA，发现了一系列的差异信号。在此基础上结合常规检测方法以及统计学和生物信息学分析，为筛选参与叶酸调控正常肝细胞恶性转化过程的相关基因打下了良好的基础。

1材料与方法

1.1材料人正常肝细胞株QSG-7701购自上海中国科学院细胞库。

1.2芯片来源及主要实验仪器RNA-Seq委托上海伯豪生物技术有限公司进行。测序所用Flow cell 为Illumina PE Flow Cell v3-HS。按照HiSeq 2500 User Guide准备测序试剂，将携有cluster 的flow cell 上机(仪器型号：HiSeq 2500，Illumina)。选用paired-end 程序，进行测序。测序过程由Illumina 提供的数据采集软件进行控制，进行实时数据分析。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养本实验中设定的细胞叶酸培养浓度：无叶酸组为0 mg/L，正常叶酸组为40 mg/L；细胞开展RNA-Seq以及其他后续试验前须经过6个月不同浓度叶酸培养，培养条件为37 ℃、5%CO2。细胞培养使用不含叶酸的特殊DMEM培养基(D2429，Sigma-Aldrich)，使用前添加10%胎牛血清、584 μg/mL谷氨酸钠，3.7 mg/mL的NaHCO3。

1.3.2细胞增殖能力检测取对数生长期的细胞接种于96孔细胞培养板，每孔接种1×103个细胞，每个实验组设置5个复孔，待细胞贴壁后加入CCK-8试剂(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies,Inc,Shanghai,China)，2 h后在酶标仪上测定各孔的吸光度(吸收波长为450 nm)。

1.3.3细胞凋亡水平检测通过流式细胞技术结合膜联蛋白A5法检测不同组细胞的凋亡水平。收取对数生长期的细胞，1000 rpm离心10 min，弃上清，加入预先配制好的膜联蛋白A5结合缓冲液，制成终浓度为1×106cell/mL的细胞悬液，取100 μL的细胞悬液，向其中加入5 μL膜联蛋白A5-FITC 结合物，再加入5 μL的PI溶液；室温下避光15 min后再加入400 μL 膜联蛋白A5结合缓冲液，在流式细胞仪上采集并分析。

1.3.4细胞迁移能力检测收取对数生长期的细胞，调整终浓度为2×105cell/mL，将200 μL细胞悬液移入小室内，小室放入24孔板，在小室外加入500 μL 含有10% 胎牛血清的培养基，培养箱中孵育24 h，取出小室擦拭掉上室面细胞，甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下计数穿膜的细胞数，每组细胞重复3次，每次计数5个视野。

1.3.5细胞总RNA的抽提使用Trizol试剂(Invitrogen)抽提QSG-7701细胞的总RNA，所得总RNA经NanoDrop ND-1000分光光度计及Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US)电泳质检合格后用于后续研究。

1.3.6实时荧光定量PCR本研究使用SYBR Green 检测法，以GAPDH为内参照进行荧光实时定量 PCR。实验所用的实时定量 PCR 引物序列如表1所示。实时定量PCR 结果以Ct值的形式直观的展现，所有样本对目的基因和内参照同时扩增，每个样本重复3次。

表1　本研究中所验证的mRNA实时定量引物序列

基因名引物序列退火温度(℃)RTEL1上游:5'CAGGACTACAAGGGTTCCGATGA3'62下游:5'CAGACCTCCTCAAACTGCTTAT3'GAPDH上游:5'GGTCTCCTCTGACTTCAACA3'60下游:5'GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT3'CCNG1上游:5'TAGTCTAACTCAGTTCTTTGGCTTTG3'58下游:5'ATGGGACATTCCTTTCCTCTTC3'SESN1上游:5'TCCACCATTTCGTGTCCAGG3'58下游:5'TAGTTCCAAATTGCCCGTCT3'GAMT上游:5'CCCACCCTGCCTGACGGTCACTTT3'62下游:5'GGGCACCTGCGTCTCCTCAAACAT3'TP53INP1上游:5'CACGGGCACAGAAGTGGAAG3'58下游:5'GGTGGCAATCCCTGGTAAGA3'CDC20上游:5'CGCCAGAGGGTTATCAGAACAGA3'60下游:5'TTCCCACTCCAATCCACAAGG3'CDC45上游:5'AGAAAGGAAGGCTGGGAACTAAG3'60下游:5'CACGTCCGAGGCCACGAAGA3'CDKN1A上游:5'TCCTGTGGGCGGATTAG3'58下游:5'CACTGTCTTGTACCCTTGTGC3'BTG2上游:5'GGCACTCACAGAGCACTACAAAC3'56下游:5'CCTCCTCGTACAAGACGCAGAT3'DHFR上游:5'AGACCTGGTTCTCCATTCCT3'56下游:5'GAACTGCCACCAACTATCCA3'

SYBR Green试剂购自Takara公司(中国大连)，PCR条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40个循环比较各组mRNA相对表达量的变化。本研究采用2-ΔΔCt的相对定量法对实时定量 PCR 的结果进行比较和分析。

1.3.7RNA-Seq检测数据的处理①基因差异表达分析： 采用Fold-change(表达差异倍数)以及Fisher精确检验统计学方法对基因差异程度进行筛选。数据经过总体归一化和对数转化后，筛选差异表达基因。筛选条件规定为 FDR控制在5%以内，差异倍数不低于2.0。筛选出受叶酸调控明显的差异表达基因。②GO 分析：首先把所有差异表达基因向Gene Ontology数据库的各个term映射，计算每个term的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的GO条目，其计算公式为

其中，N为所有基因中具有GO注释的基因数目；n为N中差异表达基因的数目；M为所有基因中注释为某特定GO term的基因数目；m为注释为某特定GO term的差异表达基因数目。计算得到的P值经过Bonferroni校正之后，以校正的P值(FDR)≤0.05为阈值，满足此条件的GO term定义为在差异表达基因中显著富集的GO term。GO分析对实验结果有提示作用，通过差异基因的GO分析可找到受不同浓度叶酸调控的基因可能与哪些基因的功能的改变有关。③ KEGG 分析：应用GO富集原理同样可以得出具有富集功能的KEGG途径。通过KEGG分析可能会找到受不同浓度叶酸调控的差异基因与哪些细胞通路的改变有关。与GO分析不同，KEGG是蛋白质之间的相互作用，KEGG的变化可能是由参与这条通路的蛋白的表达量或者是蛋白的活性的改变引起。

2结果

2.1叶酸缺乏影响人正常肝细胞的生理特征无叶酸培养的细胞CCK-8的吸收值(1.65±0.40)显著高于正常叶酸培养的细胞(0.89±0.11，P<0.01,图1A)。流式细胞技术检测显示，叶酸培养的细胞中处于静止期的比例(G0/G1，0.80±0.01)显著高于无叶酸培养的细胞(0.60±0.03，P<0.01，图1B)。无叶酸培养的细胞的凋亡比例(5.23%±0.26%)显著低于正常叶酸培养的细胞(11.32%±1.47%，P<0.01，图1C)。Transwell实验显示，24 h后，无叶酸培养的细胞穿过基底膜的数目(19.80±7.48)显著多于正常叶酸培养的细胞(3.50±2.92，P<0.01，图1D、E)。

与无叶酸组比较,*P<0.01图1　叶酸缺乏对人正常肝细胞增殖、凋亡、细胞周期以及迁移能力的影响

2.1.1叶酸缺乏促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡无叶酸条件下培养的细胞的增殖能力显著高于正常叶酸条件下培养的细胞(图1A，P<0.01)；流式细胞检测显示，无叶酸条件下的细胞的凋亡水平显著低于正常叶酸条件下培养的细胞(图1C，P<0.01)。

2.1.2叶酸缺乏促进细胞由静止期向分裂期的转化叶酸条件下的细胞中处于细胞周期静止期的比例(G0/G1)显著高于无叶酸条件下培养的细胞(图1B，P<0.01)，处于分裂期的比例(G2/M)显著低于无叶酸条件下培养的细胞(图1B，P<0.01)。

2.1.3叶酸缺乏促进细胞的迁移能力Transwell小室实验显示，无叶酸条件下的细胞的迁移能力显著高于正常叶酸条件下培养的细胞(图1D、E，P<0.01)。

2.2RNA-Seq与实时定量PCR检测的结果的一致性我们随机选择了11条RNA-Seq显示在无叶酸条件下培养的细胞和正常叶酸条件下培养的细胞中存在显著性差异的mRNA(图2)，通过实时定量PCR对其检测结果进行了验证。检测显示，11条差异mRNA中，8条存在差异且差异趋势与RNA-Seq检测结果一致，其余3条无差异，不存在差异趋势与RNA-Seq相反的mRNA，一致率达到72.73%(图3)。

图2　11条差异mRNA的RNA-Seq检测结果

图3　11条差异mRNA的实时定量PCR检测结果

2.3RNA-Seq筛选得到的差异mRNA的生物信息学分析RNA-Seq检测总共得到含有16 774条差异mRNA的数据集，根据方法中所列的一系列判断标准，最终筛选到与叶酸缺乏相关的差异mRNA共计391条，其中上调的基因共有115条，下调的共有276条。

根据以上标准判断，叶酸培养的人正常肝细胞QSG-7701中共有391个差异表达的mRNA，其中上调表达的基因共有115个，下调表达的共有276个基因。

图4　差异mRNA的生物信息学分析

GO分析显示差异mRNA所对应的基因主要包括细胞周期蛋白类、细胞信号和传递蛋白、细胞受体、叶酸代谢相关的基因与酶类、原癌基因和抑癌基因、核苷酸代谢、RNA剪接及转录活性调节、蛋白翻译合成基因等等(图4A)。KEGG分析差异mRNA所对应的基因中受叶酸调控比较明显的细胞信号通路主要是P53信号通路、细胞周期相关信号通路、TNF信号通路等等(图4B)。以上的生物信息学分析为筛选下一步研究的代谢通路和相关基因奠定了基础。通过GO分析展示结果，可看出受叶酸影响比较显著的是细胞周期阻滞，其中上调表达基因为myc，下调表达的基因主要为CDKN1A、INHA、TP53INP1等；其次为磷酸化的负调控，相关下调表达基因主要为CDKN1A、INHA等；还有诱导凋亡相关下调基因INHA、ZMAT3、TP53INP1等。

3讨论

通过本实验，我们进一步明确了叶酸缺乏对人正常肝细胞系生理特征的影响，结果显示叶酸缺乏显著刺激了细胞的增殖、细胞由静止期向分裂期的转化以及细胞的迁移，抑制了细胞的凋亡，再一次证实了叶酸缺乏能够导致正常细胞的恶性转化。但是在这些增殖、凋亡和迁移能力改变的背后，叶酸究竟通过哪些基因影响了发挥作用，目前尚不明确。为此我们选用了目前较为流行的RNA-Seq技术来筛选可能的相关差异mRNA 。对于高通量的筛选处理相关的差异基因，传统上多采用基因芯片技术，但是基因芯片技术只能检测已知序列的信息，而本研究选择的RNA-Seq技术可进行全基因组水平的基因表达差异的研究，具有检测范围广、可重复性高、分析更可靠等特点。除此之外，RNA-Seq技术还能发现新的未知转录本、剪接体、SNP等。其动态范围广，与实时定量PCR验证结果符合率高，是目前深入研究转录组的强大工具。本研究通过传统技术实时定量PCR随机对部分RNA-Seq的检测结果进行了验证，结果证明RNA-Seq的可信度较高，重复性较好，适于高通量的筛选处理相关的差异基因。

本研究通过RNA-Seq技术筛选得到了391条差异表达的mRNA，并对其中11条进行了验证，得到验证的8条mRNA所对应的基因包括与肿瘤发生相关的原癌基因、抑癌基因、与细胞周期蛋白相关基因、肿瘤坏死因子受体超家族成员、生长分化因子类、脂代谢相关基因相关(图3)，提示叶酸缺乏与肿瘤发生密切相关。进一步通过统计学和生物信息学手段分析391条差异表达的mRNA，结果显示部分差异mRNA与肿瘤的发生相关，如c-Myc、Ras等；部分差异mRNA与细胞周期相关，如Cdc20、Cdc45、RRM2等；部分差异mRNA与叶酸代谢通路相关，如FOLR1、GAMT、FPGS等。

生学信息学分析的结果提示我们，可以从叶酸代谢通路的相关基因出发，如叶酸受体FOLR1或叶酸代谢途径中的关键酶——叶酰多聚谷氨酸合成酶(FPGS)，探讨叶酸缺乏如何通过影响叶酸代谢通路，进而引起细胞内的一系列下游基因的变化，参与肿瘤的发生[6]。最新研究也发现，叶酸缺乏可以引起上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)的发生，EMT 不仅促进肿瘤细胞的侵袭和转移，也可以在肿瘤发生化疗耐药中发挥重要作用[7]，也可以从EMT的角度对叶酸参与肿瘤发生、发展的机制进行研究。

叶酸的适时适量补充可能会抑制癌基因的激活，降低癌前病变的发生，对机体的健康发展起着重要作用。人体自身仅能合成少量的叶酸，其摄入不足或者代谢障碍均可引起机体多系统受损。机体正常组织叶酸的补充可以提供DNA合成和复制的原料，因此可以确保DNA合成的保真性，维持DNA的完整性和DNA的损伤修复，均可以减少机体正常组织的恶性转变[8]。此外,叶酸提供S-腺苷甲硫氨酸甲基供体参与DNA中胞嘧啶的甲基化修饰[9]，叶酸摄入不足能够导致全基因组水平的DNA低甲基化和特定位点CPG岛启动子区的高甲基化[10-12]。因此，生物信息学的分析也提示可以通过探讨叶酸缺乏对DNA甲基化的影响，揭示叶酸缺乏导致正常细胞恶性转化的机制。

综上所述，应用转录组测序技术筛选目的基因提供了比传统的芯片技术更为广泛、更为可靠的信息。本研究结合RNA-Seq技术以及生物信息学分析所得到的一系列结果将有助于深入探讨叶酸缺乏导致正常细胞恶性转化的机制。

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(本文编辑：齐名；英文编辑：王建东)

Primry study of differential mRNA expression patterns of QSG-7701 cells treated with different doses of folic acid by RNA-Seq

ZHANGYin-ling,XUEGeng,SUNShu-han

,ZHANGYi.BasicMedicalDepartmentoftheSecondMilitaryMedicalUniversityMedicalGeneticsandResearchSection,Shanghai200433,China

[Abstract]ObjectiveTo study the differential mRNA expression patterns of QSG-7701 cells that treated with folic acid which affects cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and transwell in order to investigate the relationship of folic acid deficiency, differential gene expression and malignant transformation of human normal hepatocytes by RNA-Seq. MethodsHuman normal hepatocytes QSG-7701 were treated with folic acid (No folic acid group:0 mg/L, Normal folic acid group:40 mg/L) for 6 months. CCK-8, Flow cytometric and transwell were used to examine cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration. Real-time PCR was used to analyze and confirm RNA-Seq datas. The differential mRNA expression patterns was analyzed using bioinformatics and statistics. ResultsFolic acid deficiency promoted cell proliferation and cell migration. RNA-Seq results included 16 774 differential gene expression patterns and a total of 391 differential genes expressed in QSG-7701 cells were screened out, of which 115 were up regulated and 276 were down regulated and 11 genes were random selected to confirm by Real-time PCR. As a result, a percent of 72.73% genes were consisted with Real-time PCR. Analysis demonstrated that the abmormal gene had a close relationship with cell cycle, tumor inition and development. ConclusionGenes involved in normal cell malignant transformation can be effectively selected by RNA-Seq.

[Key words]folic acid; QSG 7701 cells; RNA-Seq; gene expression

(收稿日期：2015-09-12；修回日期：2015-10-21)

通讯作者：张毅，E-mail: yizhang@smmu.edu.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81272331)

[中图分类号]R735.7

[文献标志码]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.001