文|张仙保（内蒙古自治区包头市农牧业科学研究院）

郭梓茹 刘晓 苏小虎 张立（内蒙古农业大学生命科学学院）

张嘉祺（南京医科大学基础医学学院骨与干细胞研究中心）

不同培养条件对牛输卵管上皮细胞的影响

文|张仙保（内蒙古自治区包头市农牧业科学研究院）

郭梓茹 刘晓 苏小虎 张立（内蒙古农业大学生命科学学院）

张嘉祺（南京医科大学基础医学学院骨与干细胞研究中心）

自从1890年首次报道家兔胚胎移植获得成功以来，胚胎移植技术已有一百多年的研究历史，如今很多国家已经进入商业化应用阶段。在商业化应用上，牛的胚胎移植技术最成熟，占的比例最大。然而胚胎体外发育仍然存在诸多问题，包括囊胚效率低、胚胎质量整体偏差、发育机理不够明确、体外难以完全模拟体内环境等。输卵管是卵巢与子宫的接触和连通部位，是受精及胚胎初始发育的场所，输卵管上皮细胞有着重要的支持发育和防御功能。输卵管上皮细胞的体外培养对妊娠早期输卵管的研究及胚胎发育环境的体外模拟都具有非常重要的价值。

◎图1 不同培养条件下牛输卵管上皮细胞原代生长状态图（第三天）

◎图2 不同培养条件下P1代牛输卵管上皮细胞传代生长状态图

有研究发现，以输卵管上皮细胞作为时供体细胞，重构胚发育效果要好于其他类型细胞。然而，常规细胞培养温度为37℃，牛胚胎培养温度为38.5℃，此前未见报道不同培养温度对输卵管上皮细胞生长的影响。同时，目前大部分常规细胞培养是以DMEM/F12为基础培养液，而卵母细胞及胚胎培养都是以M199为基础培养液进行优化，这两种基础培养液对输卵管上皮细胞的生长影响差别也未见报道。因此，此研究拟对上述两个培养条件进行对比并得出细胞培养状态结果，以供参考。

一、材料

1.材料。奶牛黄体期输卵管-卵巢复合体采自内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场。

2.试剂。0.9%灭菌生理盐水由内蒙古农业大学生物制造重点实验室自配；磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS），Sigma公司生产；DMEM/F12，Hyclone公司生产；M199，Gibco公司生产；卡式瓶，Corning公司生产。

二、方法

1.培养液及培养条件。培养液配方：85%DMEM/ F12+15%FBS+1%PS；85%M199+15%FBS+1%PS。培养条件：37℃，5%CO2，饱和湿度；38.5℃，5%CO2，饱和湿度。

2.输卵管运输及取材。奶牛屠宰后，选取有黄体的卵巢剪取输卵管-卵巢复合体，生理盐水洗净后带回实验室。将输卵管外面结缔组织尽量剪去，酒精棉擦拭外表后剪去两头，取中间部分放入加2%PS的PBS中，带入超净台。

3.输卵管上皮细胞原代培养。加PS的PBS清洗3次后，用手术刀切去周围组织，清洗干净后，沿输卵管纵线轻轻划开使上皮裸露。用手术刀轻轻刮取上皮层，漂洗后收集上皮组织漂洗液移入离心管，1500转离心5分钟收集组织。离心后弃掉上清液，加入2毫升胰酶并重悬，放入37℃培养箱消化10分钟，期间每隔2～3分钟拿出震荡混匀。消化结束后，加等体积的含血清培养液终止消化，1800转离心5分钟。弃去上清，加适量完全培养液重悬细胞并计数，1×106个细胞/瓶接种于卡式瓶，按照实验设定条件培养。

4.细胞传代、冻存与复苏。待细胞长至90%汇合时，进行传代与冻存操作。因输卵管上皮细胞连接较为紧密，采用两步酶消化法以充分获取细胞并保证其生长活力，具体操作如下：弃掉培养液后，每瓶加1毫升PBS漂洗，尽量吸弃后加1毫升0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化8分钟左右。此时有部分细胞变圆，部分细胞还未有变化，加入等体积完全培养液终止消化并吹打。随后收集液体并用PBS漂洗，再次消化以收集前一步所剩细胞。传代比例为1∶3，冻存密度为1×106个/毫升。冻存液为DMEM/F12∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1，按照程序冷冻法进行。将冷冻的上皮细胞从液氮中取出后，直接投入37℃温水中摇晃解冻。利用台盼蓝排斥试验测定复苏效率。

5.不同培养条件下细胞增殖能力比较。第4代细胞以1×104个/孔接种于24孔板，每孔加入0.5毫升培养液，按实验设定条件培养。从次日起，每天取3孔，血球计数板进行计数，取其平均值，连续8天，绘制生长曲线。

三、结果与分析

1.不同培养液与培养条件下细胞原代生长状态。奶牛输卵管上皮细胞原代培养1天后，可观察到很多游动的细胞，其特征为圆形多绒毛，如纤毛虫般游动。3天后呈典型的上皮样细胞，表现为克隆状生长，细胞形态为圆形、椭圆形等铺路石状，细胞边缘光滑，触角较少或无触角。从生长状态来看，不同培养液及不同培养温度对细胞生长影响不明显，均呈现出相似的生长状态（图1）。

◎图3 P5代细胞不同培养条件生长曲线图

2.细胞传代培养与复苏效率检测。待细胞长至90%汇合时进行传代与冻存操作，复苏后的细胞在不同培养条件下生长状态大体相同（图2）：3～4天长至90%汇合，细胞呈铺路石状紧密生长。然而，M199培养基组较DMEM/F12培养基组细胞形态较大，且38.5℃培养条件下细胞存在较多的分泌泡（图2D）。产生这种现象的可能原因为38.5℃培养条件下输卵管上皮细胞更倾向于分泌各种胚胎发育所必需的生长因子，而DMEM/F12培养条件下细胞更倾向于快速扩增。经台盼蓝染色分析，细胞复苏率为89.5%，细胞解冻培养后生长良好。

3.不同培养条件下细胞增殖能力比较。P5代细胞不同培养条件下生长曲线见图3。不同培养组均为典型的S型，前2天为调整期，2～5天为对数生长期，5天后进入平台期。较M199组而言，DMEM/F12组在达到平台期时细胞总数要高，这可能与M199组细胞体积较大有关，与前述结果相吻合。不同温度组比较结果显示，37℃更适宜奶牛输卵管上皮细胞增殖。

四、讨论与结论

哺乳动物体外胚胎的发育效率远低于体内正常水平，而其发育阻滞机理并不完全明确。对体外培养胚来说，采用输卵管上皮细胞进行共培养是一个较好的选择，可以克服发育阻断，增加发育的胚胎数和提高其发育品质。通过此次实验的原代培养发现，48小时内都存在游离的可游动的绒毛状上皮细胞，3天后游离细胞明显减少，贴壁细胞呈克隆状生长，5天即可长至90%，快于其他研究者所述报道。分析其原因可能包括几个方面：血清品牌及浓度、细胞接种密度及处理方式、所取供体处于不同的情期。

DMEM/F12培养基成分较为复杂，适于克隆密度的培养。作为开发无血清配方的基础，利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分等优点，只需较低浓度的血清即可满足大多数哺乳动物细胞的培养需求。M199作为化学成分确定的细胞培养液，广泛用于卵母细胞及胚胎的培养，但其必须加入血清才可长期培养细胞。从此次研究结果来看，DMEM/F12培养基更适合输卵管上皮细胞的增殖培养及细胞学研究，而M199培养基适合作为共培养体系的基础培养成分。

动物细胞培养中，培养温度对细胞的生长影响较为明显，多数细胞对低温耐受性较强而对高温较为敏感。动物细胞标准培养温度为37℃，牛的卵母细胞及胚胎体外培养最适温度为38.5～39℃。输卵管上皮细胞作为一种成体细胞，其最适培养温度应为37℃，然而作为共培养体系支持细胞时，其培养温度应与胚胎培养温度相一致，即39℃。而不同培养温度下输卵管上皮细胞的行为不尽相同。此次研究发现，当其处于37℃时，更适于增殖；与胚胎培养温度相一致时，可以分泌更多的生长因子以支持胚胎发育。

总的来说，采用机械剥离加酶消化的方法可得到较纯的原代输卵管上皮细胞，用作细胞学研究时，应选用DMEM/F12作为基础培养成分，培养条件为37℃；而作为胚胎体外共培养体系的支持细胞时，选用38.5℃、M199培养更适宜其发挥功能。

内蒙古自治区重大基础研究开放课题（2013ZD05）