刘伶俐,万译文,伍远安,索纹纹,肖 维

(1.农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),湖南长沙 410153;2.湖南省水产科学研究所,湖南长沙 410153;3.水产健康生产湖南省协同创新中心,湖南常德 415000)



QuEChERS/液相色谱串联质谱法测定水产品中氯硝柳胺

刘伶俐1,万译文2,*,伍远安3,索纹纹1,肖 维1

(1.农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),湖南长沙 410153;2.湖南省水产科学研究所,湖南长沙 410153;3.水产健康生产湖南省协同创新中心,湖南常德 415000)

本文建立了QuEChERS/液相色谱-质谱/质谱(HPLC-MS/MS)测定水产品中氯硝柳胺残留量的分析方法。样品经氨化乙腈提取,C18吸附剂与中性氧化铝净化后,采用HPLC-MS/MS选择反应监测(SRM)负离子模式测定进行定性、定量分析。结果表明:在0.5～100 ng/mL范围内,峰面积与浓度线性良好,相关系数为0.9996;氯硝柳胺检出限(LOD)为0.2 μg/kg,定量限(LOQ)为0.4 μg/kg,检测结果的相对标准偏差为4.33%～9.91%(n=5),平均加标回收率达到74.6%～92.1%。该方法具有较高的适用性和选择性,在水产品中氯硝柳胺的残留测定中具有很好的应用前景。

氯硝柳胺,QuEChERS,液相色谱-质谱/质谱法,水产品

氯硝柳胺(Niclosamide,NIC),又名杀螺胺,是一种有效的杀虫剂,也是一种人工合成的杀螺药物[1-2],可以有效的杀灭动物体内的寄生虫和绦虫,是世界卫生组织自1972年来唯一推荐使用的灭螺药,目前国家尚未有氯硝柳胺在食品中的限量要求,其主要用于防治血吸虫[3]。由于该药物对鱼类有剧毒,会造成鱼类的死亡[4-5],因此在水产养殖过程中,渔民采用该药物清塘,灭杀杂鱼,由于效果显著,在水产上逐步被推广开来,因此在水产上的使用量越来越大。

目前国内外已经研制出的氯硝柳胺测定分析方法主要有生物测定法、滴定法、电化学分析法(electrochemical analysis)、紫外-可见分光光度法(UC)、液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、液质联用(HPLC-MS)、气质联用(GC-MS)法等[6-11]。目前应用较多的色谱法中,由于气相法与气质联用法需要衍生化,来提高分析的敏感性,前处理步骤较为繁琐,耗时较长。而采用液相色谱法通过不同溶剂来选择性分离氯硝柳胺,可得到较好的分离效果。采用液质联用法更适用于检测极性化合物而不需要衍生,相对于液相色谱法而言,能进一步降低了检出限,提高灵敏度和选择性,更适合于基底复杂的生物材料中氯硝柳胺的痕量检测。

水产品成分较为复杂,基质中含有大量的蛋白质、脂肪以及色素等杂质,氯硝柳胺作为亲脂性物质,与水产品的脂肪紧密结合。QuEChERS方法是一种快速、简单、经济、抗干扰、安全的样品前处理方法,其原理是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用,吸附杂质达到除杂净化的目的[12-14]。本文通过采用QuEChERS技术进行样品处理,通过对实验条件的筛选和实验方法的改进,利用液相色谱-质谱法联用来测定水产品中的氯硝柳胺,缩短了前处理时间,灵敏度高,能实现药物残留的快速检测,能满足水产品质检以及相关基础研究的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯硝柳胺标准品 纯度>98%,湖南省药物研究所;甲醇 色谱纯,德国Merck公司;乙腈 色谱纯,德国Merck公司;乙酸乙酯 色谱纯,德国Merck公司;C18吸附剂 70～230目,上海安谱科学仪器有限公司;无水硫酸镁 分析纯,Adamas试剂公司;中性氧化铝 分析纯,Alfa Aesar天津化学有限公司。

实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规定。所用试剂除另有指定外,均为分析纯。TSQ QUANTUM液相色谱-质谱联用仪 美国赛默飞世尔公司;分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司,感量0.0001 g;高速冷冻离心机 日本日立公司;试管震荡混匀器 美国,Fisher;步琪平行蒸发仪 瑞士buchi公司;氮气吹扫仪 美国Organomation公司。

1.2 样品预处理

取样品5.00 g(精确到0.01 g)置于50 mL离心管中,加入10 mL氨化乙腈(pH9～10),在漩涡混合仪上充分混合2 min,超声提取10 min,以6000 r/min离心10 min,取上清液于25 mL比色管中,残渣中再次加入10 mL氨化乙腈(pH9～10),重复提取1次,合并2次提取液于25 mL比色管中,用乙腈定容至刻度。

取上述提取液5 mL于10 mL离心管中,置45 ℃氮吹至干,加入1 mL 90%乙腈水溶液涡旋溶解残留物,将0.5 g C18吸附剂及0.2 g中性氧化铝加入到离心管中,涡旋混匀,充分吸附样品中的杂质和色素,10000 r/min离心8 min,取上清液经0.2 mm滤头过滤至进样瓶中,HPLC-MS/MS测定。整个样品处理过程要求避光。

1.3 标准系列测定

精确称取约5.0 mg氯硝柳胺于50 mL容量瓶中,用乙腈在超声水浴中溶解,放冷,用乙腈定容,可得到0.1 mg/mL的氯硝柳胺标准储备液。

取氯硝柳胺标准储备液适量,用甲醇逐级稀释成最终浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的标准应用液系列;分别取各标准溶液进样,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。

1.4 液相色谱-质谱联用仪条件

1.4.1 色谱条件 Hypersil Gold柱(150 mm×2.1 mm,3 μm),柱温:40 ℃;进样量为10 μL;流动相:80%乙腈+20%水,流量0.3 mL/min。

1.4.2 质谱条件 采用大气压电喷雾离子源(ESI),负离子模式;喷雾电压为-3000 V;离子传输毛细管温度为350 ℃,Q1半峰宽为0.7Da;Q3半峰宽为0.7Da;碰撞气氩气压力为1.5 mTorr;鞘气流量为12 L/min;辅助气流量为2 L/min;采用选择反应监测模式(SRM)。氯硝柳胺质谱采集参数如表1。

表1 氯硝柳胺质谱采集参数
Table 1 MS/MS acquisition parameters for Niclosamide

母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞能量(V)起始时间(min)结束时间(min)Tubelens32511352420805332511710300805332518928901908053

1.5 结果计算

试样中氯硝柳胺残留量按公式(1)计算,计算结果需扣除空白值,结果保留3位有效数字。

式(1)

式中:X-样品中氯硝柳胺残留量(μg/kg);C-样品溶液中氯硝柳胺的测量浓度(μg/mL);V-样品溶液最终定容体积(mL);m-样品称样量(kg)。

1.6 数据处理方法

样品的浓度值采用标准曲线定量得到,标准曲线采用Microsoft Excel 2010进行计算和绘制。

2 结果与讨论

2.1 流动相的组成对分离效果的影响

实验分别尝试0.1%的甲酸水溶液和乙腈(V∶V=20∶80)、甲醇和0.1%的甲酸水溶液(V∶V=80∶20)、乙腈和0.1%的氨水水溶液(V∶V=80∶20)、甲醇和0.1%的氨水水溶液(V∶V=80∶20)以及乙腈和水(V∶V=80∶20)作流动相,结果发现,在流动相中无论加入酸或碱,均会导致出峰时间严重漂移,出峰面积不稳定。这可能与氯硝柳胺的性质有关,氯硝柳胺pKa值为7.3,是两性化合物[15],因此无论是在酸性还是碱性条件下,均出现离子化不稳定的情况。而乙腈和水作为流动相时出峰峰形良好,且保留时间稳定,最终确定为流动相。

2.2 提取溶剂的选择

常用的提取溶剂有甲醇、乙腈和乙酸乙酯等,本文比较了甲醇、氨化乙腈(pH9～10)和乙酸乙酯在提取水产品中氯硝柳胺上的不同,采用甲醇和氨化乙腈(pH9～10)作为提取剂时,能较好的沉淀水产品中蛋白质,通过高速离心后容易去除,蛋白质含量低，有利于下一步过程中QuEChERS净化,而采用乙酸乙酯提取时,对水产品中的杂质提取较多,在氮吹时残留杂质不容易吹干,影响目标物回收率。而乙腈与甲醇相比,乙腈的渗透性更强,提取效果更佳,可使得氯硝柳胺的回收率更高,因此本文采用氨化乙腈作为目标物的提取剂,是由于氯硝柳胺在碱性环境中更易溶解。

表1 氯硝柳胺线性范围和检出限
Table 1 The linear range and detection limit of Niclosamide

药物线性范围(μg/L)回归方程相关系数检出限(μg/kg)定量限(μg/kg)氯硝柳胺05～100Y=50244x+27890099960204

2.3 净化方式的选择

水产品常用的净化方式有使用正己烷、固相萃取柱以及QuEChERS净化。QuEChERS采用的是分散型固相萃取进行净化,常用的吸附剂有C18、PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)、弗罗里硅土、中性氧化铝及石墨化炭黑(GCB)。吸附剂的选择和用量主要根据不同的样品基质来决定,考虑到水产品含有大量的脂肪及蛋白质且氯硝柳胺为两性化合物,本文选择C18、中性氧化铝的组合作为吸附剂,这是由于C18和中性氧化铝均为常用的吸附剂,常用于非极性到中等极性物质的吸附,具有良好的除脂能力。结果表明:当采用0.5 gC18吸附剂及0.2 g中性氧化铝作为分散型固相萃取吸附剂时,溶液清亮,基质干扰小。该方法可提高实验效率,降低成本,还有效地提高了回收率。

2.4 质谱条件的选择

根据目标物的结构特征,实验选用电喷雾ESI负离子电离模式,以流动注射泵连续进样(1.0 mg/L)进行一级质谱全扫描,扫描范围在200～400之间,得到一级质谱图和分子离子([M-H]-)峰为母离子,将该母离子进行二级质谱扫描,找出丰度最强的碎片离子为定量离子,丰度次强的碎片离子为定性离子。在此基础上对锥孔电压、碰撞能量及离子源温度进行优化,使其分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度最大时为最佳,用于后续的定性及定量工作。得到1.4.2中最佳质谱条件。

在“1.4液相色谱-质谱联用仪条件”下对氯硝柳胺标准溶液进样,得到了比较理想的色谱峰,峰形尖锐且对称性好,增大了分子离子峰的峰强度,氯硝柳胺标准溶液的多反应监测色谱图见图1。

图1 氯硝柳胺标准溶液(10 ng/mL)的多反应监测色谱图Fig.1 SRM chromatogram of Niclosamide(10 ng/mL)

2.5 标准曲线及检出限

将配制的不同浓度的标准溶液,在1.4液相色谱-质谱联用仪条件下进行测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,结果表明,氯硝柳胺浓度在0.5～100 μg/L范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系。在鱼、虾、蟹等阴性样品中添加氯硝柳胺标准溶液(添加水平为0.2 μg/kg)经测定信噪比(S/N)均大于3,表明该物质的检测下限(LOD)为0.2 μg/kg,在鱼、虾、蟹等阴性样品中添加氯硝柳胺标准溶液(添加水平为0.4 μg/kg)经测定信噪比(S/N)均大于10,表明其定量下限(LOQ)可为0.4 μg/kg。线性方程、相关系数、检出限和定量限列于表1。

2.6 精密度与准确度

采用在草鱼、对虾及中华鳖阴性样品中添加标准物质的方法,在1.0、2.0、10.0 μg/kg 3个浓度水平进行加标回收实验,每个浓度水平重复5次,方法回收率与精密度数据列于表2。由表2中可见,氯硝柳胺平均回收率在74.6%～92.1%之间,相对标准偏差在4.33%～9.91%之间,说明本方法的准确度和精密度良好。

表2 空白样品中氯硝柳胺加标回收率及精密度(n=5)
Table 2 Fortified recoveries and precision of Niclosamide in blank samples

药物添加浓度(μg/kg)平均回收率(%)相对标准偏差(%)氯硝柳胺1074686220883991100921433

2.7 实际样品测定

运用本文建立的方法对市场中的20个水产品样品进行了分析检测,样品均未检出氯硝柳胺。结果表明:该方便简单、快速,具有很好的适用性和可操作性,谱图无干扰。

3 结论

本文建立了QuEChERS/液相色谱串联质谱法测定水产品中氯硝柳胺含量的检测方法。该法具有灵敏、准确、简便、快速等优点,能满足水产品中氯硝柳胺残留监控的要求,可为氯硝柳胺在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段,对食品的安全工作提供了有力的保障。

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Simultaneous determination of niclosamide in aquatic products by QuEChERS/liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIU Ling-li1,WAN Yi-wen2,*,WU Yuan-an3,SUO Wen-wen1,XIAO Wei1

(1.Fishery Products Quality Supervision and Testing Center,Ministry of Agriculture,Changsha 410153,China; (2.Hunan Fisheries Science Institute,Changsha 410153,China; (3.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province,Changde 415000,China)

To establish an analytical method for the determination of niclosamide in aquatic products by QuEChERS/liquid chromatography-tandem mass spectrometry,the sample was extracted with acetonitril,the extract was cleaned up with C18and Alumina-N,the mass spectrometer was operated in the negative ion mode using selected reaction monitoring for the qualitative and quantitative analysis. The linear ranges were from 0.5 to 100 ng/mL with a good linear relationship(R2=0.9996). The detection limits of this method for niclosamide residues were 0.2 μg/kg,and the limits of quantification were 0.4 μg/kg. The relative standard deviations ranging from 4.33%～9.91%(n=5)and the average recovery rates were from74.6%～92.1%. The method proposed by this paper possessed higher applicability and selectivity. It is promising in real applications of determining the niclosamide residues in aquatic products.

niclosamide;QuEChERS;liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry;aquatic products

2015-12-16

刘伶俐(1981-)，女，硕士研究生，主要从事食品质量与环境分析化学工作，E-mail:25646858@qq.com。

*通讯作者:万译文(1984-)，男，硕士，讲师，研究方向：水产品质量安全和渔业生态环境监测，E-mail：cnjs3385@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)23-0316-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.050