异丙醇-硫酸铵双水相体系分离甜玉米芯多糖
2016-02-09谢静南谢褚依依
王 鑫,高 爽,谢静南,谢褚依依
(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)
异丙醇-硫酸铵双水相体系分离甜玉米芯多糖
王 鑫,高 爽,谢静南,谢褚依依
(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)
以甜玉米芯为原料,采用超声波辅助异丙醇-硫酸铵双水相体系分离甜玉米芯多糖。对影响分离甜玉米芯多糖的主要因素:异丙醇体积分数、硫酸铵用量和超声时间进行单因素研究,以多糖回收率作为响应值进行响应曲面设计分析,建立二次回归模型,优化分离条件。结果表明超声波辅助双水相体系分离甜玉米芯多糖的最佳工艺条件为:异丙醇体积分数36%、硫酸铵浓度0.25 g/mL、超声处理时间25 min。在最佳的优化条件下,甜玉米芯多糖回收率为98.98%。异丙醇-硫酸铵双水相体系分离甜玉米芯多糖具有较好的脱蛋白和脱色效果,可用于甜玉米芯多糖的分离纯化。
超声波,双水相,甜玉米芯,多糖
甜玉米是玉米的甜质型亚种,是玉米的一个变种,在西欧国家被消费者称作蔬菜玉米[1]。甜玉米芯中多糖含量较高,甜玉米芯多糖是一类多组分的水溶性多糖,其中包含少量的酸性多糖。多糖具有降血糖、降血脂、抗凝血和抗氧化等对人体有益的生物活性,可以作为药物进行开发利用。甜玉米芯经过热水浸提后获得的多糖含有蛋白质、色素等杂质,所以寻找能将甜玉米芯多糖与杂质分离,并且操作简便、条件温和、不破坏多糖结构和生物活性、多糖损失率较低的方法是甜玉米芯多糖应用的关键。
双水相体系萃取技术(Aqueous Two Phase Extraction,ATPE)是一种高效温和的生物分离新技术,优点是传质和分相速度快,原料成本低,所使用的溶剂无毒或低毒、粘度低、易回收处理,操作简便,同时,该体系温和的环境也不会引起生物物质的损伤和破坏[2]。近些年来,双水相萃取技术发展很快,产生了许多新型的体系,广泛应用在天然产物,药物分离、金属离子分离纯化等方面[3]。
过去对双水相的研究大多数局限于聚乙二醇-无机盐双水相体系,但由于高聚物难挥发,粘度大,不利于后续操作,从而引发了人们对亲水有机溶剂-无机盐双水相体系的研究[4-5]。有研究报道用丙醇-硫酸铵双水相体系萃取海带多糖[6]、条斑紫菜黄酮类物质[7]、苦荞麦苗总黄酮[8]、冬瓜籽中抗氧化物质[9]等,用乙醇-盐体系萃取香菇多糖[10]、苦参多糖[11]、螺旋藻多糖[12]、坛紫菜多糖[13]、大吴风草总黄酮[14]、丹参丹酚酸B[15]、金银花黄酮[16]、苎麻绿原酸[17]、苦参生物碱[18]等,用异丙醇-盐萃取维生素B6[19]、苏丹红[20]、镍[21]等,而国内外还没有关于异丙醇-盐萃取多糖的研究,因此本实验采用异丙醇-硫酸铵双水相体系萃取分离甜玉米芯多糖,通过响应曲面得到萃取分离的最优条件,以获得具有较高纯度和生物活性的甜玉米芯多糖,为甜玉米芯资源的开发利用提供进一步可参考的理论基础和依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
甜玉米芯(脆王) 昊伟集团有限公司;牛血清白蛋白 北京赛因坦科技有限公司;考马斯亮蓝 上海如吉生物科技发展有限公司;正己烷、硫酸、苯酚、无水乙醇、磷酸、异丙醇、硫酸铵 天津渤海化工股份有限公司。
FW177型中草药粉粹机、DK-98-11A型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;202型常压恒温烘箱 吴江欧博电热设备有限公司;TG328A型分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司;81-2型恒温磁力搅拌器 上海县曹行无线电元件厂;TDL-5-A型飞鸽牌低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;MD200-3型电子天平 上海光正医疗仪器有限公司;SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;TU-1900型双光束紫外可见分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司;BILON-1000CT超声波提取仪 上海比朗仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法[22]。
1.2.2 蛋白含量测定 蛋白质含量的测定用Bradford法。
1.2.2.1 牛血清白蛋白标准曲线绘制 准确称取100 mg牛血清蛋白,蒸馏水定容至100 mL,配置成1 mg/mL的标准蛋白液。准确称取考马斯亮蓝G-250 100 mg,加入50 mL 95%乙醇和100 mL 85%磷酸溶液,蒸馏水定容至1000 mL,配制成考马斯亮蓝溶液[23]。分别在试管中加入牛血清白蛋白溶液0、25、50、75、100 μL,用蒸馏水补足到100 μL,加入5 mL考马斯亮蓝溶液,混合均匀,静置5 min,然后在595 nm波长下测定各管的吸光值。以蛋白质浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,得到蛋白质浓度标准曲线方程。
1.2.2.2 样品蛋白质含量的测定 取样品溶液0.2 mL,加蒸馏水定容至1 mL,加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀后静置5 min,595 nm下测定吸光度。根据蛋白质标准方程计算样品中蛋白质含量。
1.2.3 异丙醇-硫酸铵双水相相图绘制 精确量取5 mL 40%的异丙醇溶液于50 mL锥形瓶中,置于电子天平上,加入50%(NH4)2SO4溶液,摇匀,烧杯中溶液变混浊时停止加入(NH4)2SO4溶液,记录加入(NH4)2SO4溶液的质量,再加入水使烧杯中溶液由混浊变澄清,记录加入水的质量,继续加入(NH4)2SO4溶液,使溶液再次混浊,反复重复上述操作。根据公式(1)和(2)计算达到成相点时溶液中和(NH4)2SO4和异丙醇的质量百分数,得到异丙醇/(NH4)2SO4双水相体系的相图。
式(1)
式(2)
式中:X:在某成相点时硫酸铵占总量的质量百分数,%;Y:在某成相点时异丙醇占总量的质量百分数,%;N:在某成相点时硫酸铵在双水相中的总量,g;C:在某成相点时异丙醇在双水相中的总量,g;W:在某成相点时水在双水相中的总量,g 。
以X为横坐标,Y为纵坐标,绘制异丙醇-硫酸铵的双水相相图。
1.2.4 甜玉米芯多糖溶液的制备 甜玉米芯经烘箱50 ℃干燥,用粉碎机粉碎,过80目筛,用正己烷脱脂。甜玉米芯在温度100 ℃、料液比1∶20(g∶mL)、时间3 h的条件下进行热水浸提,离心,取上清液,得到甜玉米芯粗多糖溶液,于4 ℃贮存备用。
1.2.5 双水相体系的配制 根据异丙醇-硫酸铵双水相相图,向25 mL比色管中加入一定量的硫酸铵,再加入适量甜玉米芯多糖液,硫酸铵完全溶解后,最后加入异丙醇至20 mL,形成双水相体系,用超声波处理一定时间,于分液漏斗中静置分层,测定上下相体积并根据公式(3)计算相比(R),取上下相测定多糖含量。根据公式(4)和(5)计算甜玉米芯多糖的分配系数(K)和回收率(Y)。
式(3)
式(4)
式(5)
式中:R:上下相体积比;Vt:双水相体系的上相体积,mL;Vb:双水相体系的下相体积,mL;K:甜玉米芯多糖在双水相体系中的分配系数;Ct:甜玉米芯多糖在双水相体系中上相的质量浓度,μg/mL;Cb:甜玉米芯多糖在双水相体系中下相的质量浓度,μg/mL;Y:甜玉米芯多糖在下相的收率,%。
1.2.6 单因素实验 在室温25 ℃、超声功率500 W、超声频率45 Hz、异丙醇体积分数25%～50%、硫酸铵用量0.175～0.300 g/mL、超声时间10～35 min的条件下,研究不同体积分数的异丙醇、硫酸铵用量和超声时间对双水相萃取的影响。
1.2.7 响应曲面优化实验 采用Design-Expert 7.0软件,在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken中心组合原理,确定实验的因素与水平。以多糖回收率为响应值,通过响应面分析优化甜玉米芯多糖萃取条件。
2 结果与讨论
2.1 多糖和蛋白标准曲线
葡萄糖标准曲线回归方程为:y=0.0146x+0.0021(R2=0.9994;y,吸光值;x,葡萄糖浓度,μg/mL);蛋白标准曲线回归方程:y=0.1704x-0.0018(R2=0.9994,y,吸光值;x,牛血清白蛋白浓度,mg/mL)。
2.2 异丙醇-硫酸铵双水相相图
由图1可知,异丙醇和硫酸铵在较大质量分数范围内都能形成双水相体系。当异丙醇质量分数和硫酸铵质量分数的配比点在相图左下方时,不能形成双水相,相图左下方是均相区;当异丙醇质量分数和硫酸铵质量分数的配比点在相图右上方时,双水相体系分为上、下两相,相图右上方是双水相区。因此异丙醇与硫酸铵必须在一定配比下才能形成双水相。在异丙醇/硫酸铵双水相体系中上相中主要含有异丙醇,下相中主要含有硫酸铵。
图1 异丙醇-硫酸铵双水相相图Fig.1 Phase diagram of isopropyl alcohol-ammonium sulfate aqueous two-phase
2.3 单因素实验结果分析
2.3.1 异丙醇体积分数对双水相萃取的影响 在室温25 ℃、硫酸铵用量0.25 g/mL、超声时间25 min的条件下,考察异丙醇体积分数对双水相萃取甜玉米芯多糖的影响。由表1可知,随着异丙醇体积分数的增加,相比R逐渐减小,多糖分配系数和回收率逐渐增加,而蛋白分配系数逐渐减少。当异丙醇体积分数为35%时,上相呈淡黄色,下相几乎无色,蛋白分配系数达到最小为1.12,多糖分配系数和回收率达到最大,分别为49.09%和98.92%,说明色素和蛋白质富集在上相,多糖富集在下相,双水相的分离纯化效果最好。多糖在盐相中的溶解度大于在异丙醇中的溶解度,异丙醇体积分数增加,使双水相的分相能力下降,伴随异丙醇体积分数的增加,相比开始有减小的趋势,蛋白分配系数增大,多糖分配系数和回收率减小。这是由于异丙醇增加到一定浓度时,异丙醇和(NH4)2SO4相互作用力增大,进而增大了多糖在双水相间的传质阻力,使得多糖不易进入下相,因此,选择35%作为双水相体系的异丙醇体积分数。
表1 异丙醇体积分数对双水相萃取的影响
Table 1 Influence of isopropyl alcohol volume fraction on two-phase extraction
异丙醇体积分数(%)相比蛋白分配系数多糖分配系数回收率(%)25400163717966330257145233798363518711249099892401351783359978445102192283096655008523021389478
2.3.2 硫酸铵用量对双水相萃取的影响 在室温25 ℃、异丙醇体积分数40%、超声时间25 min的条件下,考察硫酸铵用量对双水相萃取的影响。由表2可知,当固定异丙醇体积分数为40%时,随着体系中(NH4)2SO4浓度的增加,上下相的相比逐渐增大,多糖分配系数和回收率逐渐增加,而蛋白分配系数逐渐减小。当(NH4)2SO4用量为0.25 g/mL时,多糖分配系数和回收率达到最大,分别为34.34%和97.93%,并且蛋白分配系数达到最小为1.81。随着(NH4)2SO4用量继续增加,多糖分配系数和回收率逐渐减小,而蛋白分配系数逐渐增大。因为(NH4)2SO4浓度增加,相比增加,下相体积增大,对多糖的浓缩不利,而且(NH4)2SO4浓度过高会有(NH4)2SO4沉淀析出,抑制了多糖在下相中溶解,不利于多糖在下相富集,所以(NH4)2SO4用量不宜太多,加入过多的(NH4)2SO4反而达不到分离纯化的效果,还会导致(NH4)2SO4的浪费。所以(NH4)2SO4用量为0.25 g/mL比较合适。
表2 硫酸铵用量对双水相萃取的影响
Table 2 Influence of ammonium sulfate dosage on two-phase extraction
(NH4)2SO4用量(g/mL)相比蛋白分配系数多糖分配系数回收率(%)017512227416529527020013025020749642022513322024449702025013818134349793027514421428529762030014726921769697
2.3.3 超声时间对双水相萃取的影响 在室温25 ℃、硫酸铵用量0.175 g/mL、异丙醇体积分数30%的条件下,考察超声时间对双水相萃取的影响。由表3可知,当异丙醇体积分数为30%,硫酸铵用量为0.175 g/mL时,随着超声时间的延长,上下相的相比基本没有变化,多糖分配系数和回收率逐渐增加,而蛋白分配系数逐渐减小。当超声时间为25 min时,蛋白分配系数达到最小为1.40,此时多糖分配系数和回收率分别为8.46%和95.17%,而在超声时间为30 min时,多糖分配系数和回收率达到最大,分别为8.96%和95.43%,此时蛋白分配系数为1.72,表明超声时间25 min蛋白脱除效果最好,超声时间30 min多糖回收率95.43%与超声时间30 min多糖回收率95.17%的误差为0.3%,在误差允许范围内。随着超声时间延长,多糖分配系数和收率逐渐减小,而蛋白分配系数逐渐增大。因为超声时间过长会破坏多糖结构,所以超声时间25 min最佳。
表6 回归方程系数显著性检验
Table 6 Regression equation coefficient significance test
项目系数估计自由度标准差平方和F值p值模型98911003461111663<00001x1-01910027030509000002x201210027012197800030x30097100270076130600086x1x201110038004679400259x1x30043100387225E-00312403022x2x3-008810038003152600556x12-1071003748382884<00001x22-034100370478149<00001x32-0046100378813E-00315102584
表3 超声时间对双水相萃取的影响
Table 3 Influence of ultrasonic time on two-phase extraction
超声时间(min)相比蛋白分配系数多糖分配系数回收率(%)102452815859348152452666929443202332057939487252331408469517302331728969543352332366329364
2.4 响应曲面优化双水相萃取
2.4.1 实验结果与方差分析 采用多元回归分析,拟合二次多项式回归模型的Box-Behnken设计及实验结果如表4所示:
表4 响应面实验设计与结果
Table 4 Design and results of response surface experiments
实验号异丙醇体积分数(%)硫酸铵用量(g·mL-1)超声时间(min)多糖回收率(%)10(35)0(025)0(25)988720-1(0225)1(30)985630-1-1(20)98264-1(30)0198135000989361(40)019773701(0275)-198688011986391-10971410-1-10976411-10-197951200098991300098921410-1973815110975916000988617-1109766
超声波辅助双水相萃取甜玉米芯多糖的实验结果见表4。利用Design Expert 7.0软件对表4数据进行多元回归拟合,获得超声波辅助双水相萃取甜玉米芯多糖的异丙醇体积分数(x1)、硫酸铵用量(x2)和超声时间(x3)的二次多项回归模型方程为:
Y(%)=98.91-0.19x1+0.12x2+0.097x3+0.11x1x2+0.043x1x3-0.088x2x3-1.07x12-0.34x22-0.046x32
注:Y-多糖回收率,%;x1-异丙醇体积分数,%;x2-硫酸铵用量,g·mL-1;x3-超声时间,min。
从回归方程的方差分析表5可见,对于模型来说,F模型=116.63,p模型<0.0001<0.01,表明拟合得到的模型方程极显著,不同处理间的差异极显著;F失拟=3.64,p失拟=0.1218,不显著;模型的决定系数R2=0.9934,校正决定系数的变化为0.9849,仅有大约0.078%总变异不能用此模型来解释,说明该模型拟合程度良好,实验误差小,该模型是合适的,可以用此模型分析和预测双水相萃取甜玉米芯多糖的回收率。异丙醇体积分数、硫酸铵用量和超声时间三个因素对双水相萃取甜玉米芯多糖的回收率的影响大小次序为:异丙醇体积分数>硫酸铵用量>超声时间。
表5 响应面模型方差分析
Table 5 Variance analysis of response surface model
变异源平方和自由度均方和F值p值模型6.1190.68116.63<0.0001失拟项0.03039.950E-0033.640.1218纯误差0.01142.730E-003总和6.1516r=0.9967,R2=0.9934,R2Adj=0.9849
图2 各因素交互作用对多糖回收率影响的响应面分析Fig.2 Response surface analysis of the effect of process parameters on the yield of polysaccharides
从表6回归方程系数显著性检验可知,异丙醇体积分数、硫酸铵用量、超声时间、异丙醇体积分数的平方及硫酸铵用量的平方对多糖回收率的影响极显著(p<0.01);异丙醇体积分数和硫酸铵用量的交互作用对多糖回收率的影响显著(0.01
2.4.2 各因素交互作用的分析与优化 考察各因素交互作用对甜玉米芯多糖回收率的影响,进行等高线图和响应曲面图的绘制,结果如图2所示。
从图2的响应面图可知,随着各两因素的增大,多糖回收率逐渐升高,当各两因素增大到一定程度时,多糖回收率达到最大值,伴随各两因素继续增加,多糖回收率逐渐降低。图2的等高线图说明,异丙醇体积分数与硫酸铵用量的交互作用影响较大,硫酸铵用量与超声时间的交互作用影响次之,异丙醇体积分数与超声时间的交互作用影响最小。
通过Design-Expert 7.0软件分析可知超声波辅助双水相萃取甜玉米芯多糖的最优工艺条件为:异丙醇体积分数36.8%、硫酸铵用量0.2496 g/mL、超声时间24.81 min。在此最优条件下预测得到的甜玉米芯多糖回收率为98.70%。根据实际操作条件,进一步优化超声波辅助双水相萃取甜玉米芯多糖的工艺条件,即:异丙醇体积分数36%、硫酸铵用量0.25 g/mL、超声时间25 min。在此条件进行验证实验,实际多糖回收率为98.89%。回归方程所得的预测值98.91%与验证实验值98.89%的误差为0.2%,在误差允许范围内,说明回归方程能较真实地反映各筛选因素对甜玉米芯多糖回收率的影响,证明应用响应曲面法确定的回归模型较可靠,响应面优化的超声波辅助双水相萃取甜玉米芯多糖工艺条件可以应用到实际生产中。
3 结论
以甜玉米(脆王)的废弃物甜玉米芯为主要原料,通过单因素及Box-Benhnken中心组合设计实验方案,建立二次回归模型。确定超声波辅助双水相萃取甜玉米芯多糖的最佳工艺条件为异丙醇体积分数36%、硫酸铵用量0.25 g/mL、超声时间25 min。在此优化条件下甜玉米芯多糖回收率为98.89%。经验证实验证明该模型合理可靠,能较好预测超声波辅助异丙醇-硫酸铵双水相体系分离甜玉米芯多糖的多糖回收率。并且能够起到较好的脱蛋白和脱色效果。因此,可以利用异丙醇-硫酸铵双水相体系精制甜玉米芯多糖,大大提高了多糖的纯度,具有较好的应用价值。
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Isolation of polysaccharide from sweet corncob using isopropyl alcohol-ammonium sulfate aqueous two-phase system
WANG Xin,GAO Shuang,XIE Jing-nan,XIE CHU Yi-yi
(Key Laboratory of Food Science and Engineering,School of Food Engineering, Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)
Isolation of polysaccharides using isopropyl alcohol-ammonium sulfate aqueous two-phase system with ultrasonic-assisted method from sweet corncob. The main factors affecting the separation of polysaccharides from sweet corncobs were researched such as:isopropyl alcohol volume fraction,the concentration of ammonium sulfate,ultrasonic time. The response surface was designed and quadratic regression model was established with polysaccharides recovery as response values for optimizing the separation conditions. The results showed that the optimum conditions of ultrasonic-assisted isopropyl alcohol-ammonium sulfate aqueous two-phase system were isopropyl alcohol volume fraction,the concentration of ammonium sulfate,ultrasonic time was 36%,0.25 g/mL and 25 min,respectively,the yield of polysaccharides under this condition was up to 98.98%. The separation of sweet corn cobs polysaccharides with isopropyl alcohol ammonium sulfate aqueous two-phase system has a good deproteinization and decolorization effect,thus,it can be used for the isolation and purification of polysaccharides from sweet corncob.
ultrasonic;aqueous two-phase system;sweet corncob;polysaccharides
2016-05-10
王鑫(1984-)，女，在读博士，讲师，研究方向：食品营养与安全、农产品加工及贮藏，E-mail:wangxinfood@163.com。
哈尔滨商业大学研究生创新项目YJSCX2015-392HSD。
TS255.1
B
1002-0306(2016)23-0170-06
10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.024
