王乐，卢建国，王平平，栾培贤，王秋实，孙效文

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070）

黄颡鱼cGnRH基因的筛选鉴定及生物信息学分析

王乐，卢建国，王平平，栾培贤，王秋实，孙效文

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070）

本研究在前期已获得的黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco转录组基础上，利用BLAST程序从中筛选获得黄颡鱼cGnRH基因的候选序列，再通过氨基酸序列分析从中筛选获得cGnRH的全长cDNA为261bp，编码86个氨基酸，其核心十肽的序列为QHWSHGWYPG，相对分子质量为9 755.5、理论PI值为9.02。序列同源比对发现：黄颡鱼与斑马鱼Danio rerio、草鱼Ctenopharyngodon idella、鲤Cyprinus carpio中cGnRH氨基酸的相似性分别高达70.93%、68.60%和67.44%。用MEGA构建的黄颡鱼与其他27种硬骨鱼cGnRH的Neighbour-joining进化树发现，黄颡鱼cGnRH先与脂鲤科的墨西哥丽脂鲤Astyanax mexican共聚类，再依次与鲤科的斑马鱼、草鱼、黑头呆鱼Pimephales promelas、稀有鮈鲫Gobiocypris rarus等鱼的cGnRH序列聚类。本研究首次筛选获得黄颡鱼的cGnRH序列，并利用生物信息学软件进行鉴定分析，为后续的基因表达和cGnRH调节生长生殖作用的研究提供序列资源及基础。

黄颡鱼；促性腺激素释放激素；序列分析

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco主要产于长江支流，广泛分布于长江、黑龙江、珠江等内陆水域[1]。黄颡鱼肉质细嫩鲜美，无肌间刺，富含蛋白质，是一种重要的淡水鱼类，深受消费者喜爱的美味，具有重要的经济价值，在日本、韩国、东南亚等国家亦有巨大的市场，是出口创汇的优良鱼类[2]。但由于其生长较为缓慢，雌鱼更甚，限制了黄颡鱼的养殖及推广[3]。

促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）是一个保守的神经家族，具有调节生物性腺发育和诱导性成熟的作用。经过几十年的研究，已从多种脊椎动物和硬骨鱼中获得GnRH的基因序列[4]。一般在硬骨鱼中有3种类型的GnRH基因：sbGnRH、cGnRH及sGnRH，其中sbGnRH的主要功效为调节促性腺激素的合成与释放；cGnRH作为神经递质间接参与鱼类生长的生殖调节；sGnRH的功能与cGnRH相近，但并不存在于所有的硬骨鱼中[5]。cGnRH广泛存在于各种脊椎动物中，处于高度保守的进化地位[6]。目前，国内外关于黄颡鱼中GnRH基因的研究还处于初级阶段。本研究在前期已获得的黄颡鱼转录组基因数据基础上，通过初步筛选、分析鉴定黄颡鱼的cGnRH基因，为后续探索GnRH基因在黄颡鱼生长发育及生殖代谢中的作用提供基因序列基础。

1 材料和方法

1.1 候选基因的筛选与获得

利用BLAST程序将本课题组前期已测序获得的黄颡鱼转录组基因数据与美国国家生物技术信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索数据库中已公开发布的硬骨鱼cGnRH基因进行比对，从中选择相似度高的基因序列作为候选序列待测。

1.2 候选基因确定

利用DNAMAN 6.0软件获取候选基因的开放读码框序列（ORF）和各基因的氨基酸序列，比对核心十肽的序列，筛选获得cGnRH的准确序列。

1.3 生物信息学分析

利用Expasy的Protparam工具分析cGnRH基因所编码氨基酸序列的基本理化性质，如相对分子质量、理论PI值、氨基酸组成及不稳定系数等信息；用Expasy的SOPMA功能分析蛋白质的二级结构；利用PredictProtein平台进行功能预测与注释。

1.4 亲缘关系的分析

选取数据库中已发表的其他种属鱼的cGnRH氨基酸序列，用Clustal X软件比较、整理氨基酸序列的同源性，利用MEGA构建cGnRH的Neighbour-joining进化树，重复抽样1 000次。

2 结果与分析

2.1 黄颡鱼cGnRH的序列分析

黄颡鱼cGnRH的全长cDNA为261bp，编码86个氨基酸（图1），含有23个信号肽，其核心十肽的序列为QHWSHGWYPG。Expasy的Protparam工具分析结果表明：cGnRH的相对分子质量为9 755.5、理论PI值为9.02，亮氨酸Leu（L）的含量最高，为17.4%，且不含有氨基酸Pyl（O）和Sec（U）。带负电荷的残基总数（Asp+Glu）为8个，而带正电荷的残基总数（Arg+Lys）为12个；理论计算得到的分子式为C441H708N120O119S5，总原子数为1 393个。除此之外，其不稳定系数为37.28，说明该蛋白比较稳定。脂肪系数为106.63，总平均吸水数为-0.029。为了更好地理解分析蛋白质的二级结构，利用DNAMAN软件分析该cGnRH氨基酸序列的亲水性（图2）。

图1 黄颡鱼cGnRH的全长cDNA及氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence and amino acid sequence of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

图2 cGnRH的氨基酸序列亲水性分析Fig.2 Hydrophilic analysis of amino acid sequence of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

用Expasy的SOPMA功能分析得到cGnRH氨基酸序列的α螺旋、β折叠及其他的二级结构（图3）。用PredictProtein平台分析序列得到氨基酸组成示意图（图4），对序列的多功能区域进行注释及特征预测所得到的结果如图5所示。

2.2 cGnRH的比对分析

将本研究鉴定获得的黄颡鱼cGnRH氨基酸序列与NCBI数据库中的斑马鱼（NP_852104.3）、草鱼（ACH78253.1）及鲤（AAO39753.1）等硬骨鱼的cGnRH氨基酸序列进行比对。Clustal X比对结果表明，各硬骨鱼的cGnRH氨基酸序列具有很高的相似性（图6）。DNAMAN软件分析的相似度结果表明，黄颡鱼的cGnRH氨基酸序列与斑马鱼、草鱼、鲤的相似性分别为70.93%、68.60%及67.44%。它们之间共同的相似性高达87.79%。这些比对结果证明了cGnRH保守性极高的同时，也进一步验证了本研究所得序列的正确性。

2.3 亲缘关系分析

选取NCBI数据库中已公开发表的其他27个种属硬骨鱼的cGnRH氨基酸序列构，采用其他种属硬骨鱼的检索信息（表1），利用MEGA 4.0构建黄颡鱼cGnRH的系统进化树（图7）。结果表明：黄颡鱼cGnRH先与脂鲤科的墨西哥丽脂鲤Astyanax mexican共聚类，再依次与鲤科的斑马鱼、草鱼、黑头呆鱼Pimephales promelas、稀有鮈鲫Gobiocypris rarus等的cGnRH序列聚类，说明黄颡鱼cGnRH序列与淡水鱼，尤其是鲤科鱼类的同源性较高，保守性较好，证明本研究所获得的黄颡鱼cGnRH序列的正确性。

图3 黄颡鱼cGnRH的蛋白质二级结构图Fig.3 The secondary structure of cGnRH protein in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

图4 cGnRH氨基酸组成示意图Fig.4 The schematic diagram of amino acid composition of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

图5 功能注释及特征预测Fig.5 Functional annotation and feature prediction of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

表1 用于构建亲缘关系树的其他物种序列信息Tab.1 The sequence information of other species used to construct phylogenetic trees

3 讨论

本课题组前期利用高通量测序技术对雌雄黄颡鱼不同发育时期的脑及性腺组织进行了转录组测序，通过装配整理及基因注释获得了大量的黄颡鱼转录组数据资源，在此基础上针对雌雄黄颡鱼性别决定基因进行了大量的研究分析工作[7,8]。这些资源和成果为黄颡鱼的生长发育调节和性状研究提供了重要的基础。本研究在这些成果的基础上，进一步对生长调控基因GnRH进行挖掘和鉴定。

GnRH在鱼类性腺发育和成熟的内分泌调节中起重要作用。早在20世纪80年代，方永强等[9]就通过注射促性腺激素释放素类似物（GnRH-A）诱导文昌鱼性腺过早发育。GnRH基因的突变还会导致生物生殖生长异常变化。黎双飞等[10]利用反义转基因技术成功实现了脑水平调控鱼类性腺发育，获得了败育的转基因鲤。这些研究充分证明了GnRH对鱼类生长性状的显著调控作用。GnRH是下丘脑分泌的由10个氨基酸构成的高度保守的肽类物质[11]。现阶段已经完成了包括鲤、斑马鱼、双棘黄姑鱼Protonibea diacanthus等在内的许多鱼类GnRH基因的序列分析及鉴定工作[12-14]。在已鉴定过的GnRH十肽中，1、4、9、10位的氨基酸序列都是完全保守的，基本结构都是pGlu（1）—…—Ser（4）—…—Pro（9）-Gly（10）-NH2，这也为GnRH的筛选鉴定工作提供了重要的参考信息[10,15]。本研究所鉴定分析得到的黄颡鱼cGnRH氨基酸序列也完全符合这一特点，含有23个信号肽和10个核心肽，这也与其他脊椎动物中的cGnRH基本结构相一致[16-18]。

图6 黄颡鱼cGnRH与其他种属鱼的氨基酸序列比对Fig.6 Comparative sequence alignment of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco with other teleosts

图7 黄颡鱼cGnRH的系统进化树Fig.7 The phylogenetic tree of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

鱼脑中cGnRH主要分布在中脑区域，cGnRH肽不仅参与硬骨鱼生长激素的调节，也与一些其他垂体激素的分泌密切相关[19]。大量研究表明，生长激素在调节鱼类的生长生殖及性别分化中具有极为重要的作用[20]。本研究所鉴定获得的黄颡鱼cGnRH基因有待后续进一步验证研究基因的表达，同时也为探索cGnRH对黄颡鱼生长性状的调节作用奠定了极为重要的前期工作基础。

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Screening,Identification and Bioinformatics of cGnRH Gene in Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）

WANG Le,LU Jian-guo,WANG Ping-ping,LUAN Pei-xian,WANG Qiu-shi,SUN Xiao-wen
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In previous studies,our group has obtained transcription data of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco,and in current study candidate sequences of cGnRH gene were screened and sequenced using the blast program and amino acid sequence analysis.Results showed that full-length cDNA of cGnRH was found to be 261 bp,encoding 86 amino acid sequences,with ten core peptides of QHW SHGWYPG,relative molecular mass of 9 755.5 and the theory PI of 9.02.The similarity of cGnRH amino acids in yellow catfish was as high as 70.93%to zebrafish Danio rerio,68.60%to grass carp Ctenopharyngodon idella,and 67.44%to common carp Cyprinus carpio.The neighbour-joining phylogenetic tree of cGnRH amino acids in yellow catfish and 27 other teleosts was established using MEGA.The cGnRH of yellow catfish was found to be co-clustered with Astyanax mexicanus in Characidae preferentially,then co-clustered with zebrafish,grass carp,Pimephales promelas and Gobiocypris rarus in Cyprinidae.The cGnRH sequence of yellow catfish was screened first time,and analyzed and identified using bioinformatics.The findings provide foundation for gene expression subsequently,and necessary sequence resources for analysis of the regulation of cGnRH in reproduction and growth.

Pelteobagrus fulvidraco;GnRH;sequence analysis.

S917.4

A

1005-3832（2016）04-0001-05

2016-04-29

黑龙江省科学基金项目（QC2016045）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（HSY201505）.

王乐（1988-），男，助理研究员，博士研究生，从事分子生物学与生物技术研究.E-mail:wangle0455@163.com

孙效文（1955-），研究员，博士生导师.