畅丽芳

(吉林省五星动物保健药厂吉林长春130062)

犬致病性大肠杆菌分离与鉴定的临床意义

畅丽芳

(吉林省五星动物保健药厂吉林长春130062)

为了探究犬致病性大肠杆菌的耐药性，以对临床上的用药进行指导，本研究使用鉴别性的培养基将大肠杆菌从有腹泻症状的犬肛拭子病料中分离出来，而后运用生理生化以及分子生物学鉴定法对分离出来的菌株进行鉴定，并且检测它的致病性以及对药物的敏感性。研究结果显示，9份病料都分离出了大肠杆菌共9株，这其中的7株大肠杆菌都有致病性，其他们对临床上一些常见的药物（16种）有程度不一的耐药性，有2株耐受16种抗生素，这值得临床上高度重视。这些大肠杆菌菌株对复方新诺明、氨苄西林以及四环素等早期使用的药物耐药性更强，而对头孢西丁、阿米卡星以及磷霉素则较为敏感，所以建议使用这3种药治疗有腹泻症状的犬。

犬；大肠杆菌；分离；耐药性当前，腹泻已经是威胁犬类健康的一种重大疾病，特别是由犬瘟热以及犬细小病毒导致的大肠杆菌继发性感染严重降低了患病犬的存活率而在这两种病的发展以及传播中继发性的细菌感染起到了主要的作用。有研究显示[1]，在此过程中，继发性感染的主要细菌是大肠杆菌与沙门菌。而在我国，对于宠物的临床治疗工作中使用抗生素方面往往不谨慎不合理，使得大肠杆菌具有耐药性且其耐药性在不断的变强。而宠物身体携带的耐药性较强的菌在宠物和人接触的过程中可能会传染给人，进而危害到人的健康。所以，分离和坚定犬致病性大肠杆菌在临床上有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 采集样品

从本动物医院采集出现腹泻症状的犬9只，其中有5只犬是患有细小病毒病，2只是患了犬瘟热，另外2只是普通腹泻。使用灭过菌的棉拭子从每只犬的肛门处进行粪便的采集工作，将采集物放置到试管中，加入适量的经过灭菌处理的生理盐水，而后将试管放置在摇床上进行为期4 h的震荡操作，而后放置备用。

1.2 主要试剂

营养肉汤（可用琼脂替代），伊红美兰、麦康凯以及三糖铁培养基，药敏纸片，大肠杆菌ATCC29213以及ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923以及细菌生化反应管

1.3 实验动物

购买清洁级的ICR小鼠。

1.4 细菌的分离培养按照一定的比例稀释采集得到的样品，将稀释液涂在麦康凯琼脂平板上，在37℃的恒温条件下培养48 h以后仔细查看菌落的生长状况。从中挑呈粉红色的单个的菌落接种到伊红美兰培养基中，在恒温37℃的环境下培养48 h。仔细观察菌落的生长情况，从中挑选单个的颜色呈紫黑色并且带有金属光泽的菌落制作细菌的涂片，而后进行革兰氏染色，进行显微镜检测。

1.5 PCR鉴定

按照煮沸法来进行PCR模板的制备工作，首先挑取单个的菌落接种到营养肉汤中，37℃恒温环境下培养一夜，取1 mL的培养物在每分钟10 000转的离心机上离心1 min，弃掉上清液并加200μL超纯水，进行重悬并15 min的沸水浴，每分钟10 000转的离心机上进行2分钟离心后上清液就是DNA模板。

在PCR反应体系中加入足量的引物、DNA模板、PCR Mix以及超纯水，在一定的条件下进行反应，得到的产物在2%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测。将大肠杆菌ATCC29213和金黄葡萄球菌ATCC25923分别作为阳性和阴性的对照物。

1.6 小鼠致病性试验

将经过鉴定的9株大肠杆菌接种在营养肉汤中，37℃恒温下培养一夜，进行离心操作以后加入等量的经过灭活的生理盐水进行重悬，而后进行梯度稀释并计数菌落。把细菌的浓度调到107 CFU/mL左右，接种在每只平均重量在20 g左右的小鼠的腹腔中，剂量为每只接种0.2 mL，每10只分成一组。对照组则给小鼠接种相同剂量的经过灭菌处理过的生理盐水。隔离喂养接种的小鼠，观察和记录其发病和死亡的情况。一旦发现死亡的小鼠马上进行解剖在无菌条件下取肝及脾在麦康凯平板上划线培养[2]。

1.7 药敏试验

利用制片扩散法对9株大肠杆菌对于16种抗生素的敏感性进行检测。

2 结果

2.1 细菌分离培养

采集到的9份样品中分离出9株细菌，它们在麦康凯培养基上出现边缘整齐的直径在1～2 mm的圆形菌落，四周为粉红色而中心呈深红色。在伊红美兰培养基上出现边缘整齐的圆形菌落，呈现紫黑色并伴有金属光泽。进行革兰氏染色后镜检可以看见中等大小两端钝圆且无芽孢，呈红色多分散的杆菌。这与大肠杆菌的培养结果相符。

2.2 PCR鉴定

分离出的9株菌与大肠杆菌ATCC29213一样都能扩增出262bp的目的基因，而金黄色葡萄球菌则没有扩增。说明分离出来的9株菌是大肠杆菌。

2.3 小鼠致病性试验

接种生理盐水的对照组小鼠没有任何症状，十分健康。而实验组小鼠中，接种5、7号菌株的小鼠无异常症状。其他小鼠在接种后2 h出现拉稀症状，且出现厌食、昏睡以及扎堆等症状，还有部分出现抽搐以及瘫痪的症状。第2～3天有死亡小鼠出现。解剖后在无菌条件下取肝脾在培养基上划线重新分离得到了红色的大肠杆菌。9菌株中有7株是致病性的大肠杆菌，2株未引起病变可能是犬肠道内的正常菌群里的大肠杆菌。

2.4 药敏试验

药敏试验结果显示，在7株致病性的大肠杆菌里，6及8号菌株对全部的抗生素（16种）都表现出了耐药性，且有超过半数的菌株都对庆大霉素、阿莫西林、四环素、氨苄西林、哌拉西林以及磺胺异恶唑和复方新诺明出现耐药性。而对阿米卡星、磷霉素、头孢西丁则较为敏感。

3 讨论

导致犬发生腹泻的因素十分的复杂，临床上可将主要的病因划分为细菌性和病毒性，而细菌性的病原体又分为大肠杆菌、弯曲杆菌等[3]，最常见的则是大肠杆菌导致的腹泻。病毒性腹泻中常见的有犬瘟热以及犬细小病毒病，二者的诱因又是以大肠杆菌和沙门菌为主。本实验中的7株致病菌导致小鼠出现严重程度不一的腹泻以及死亡。

研究结果显示，分离得到的大肠杆菌对早期使用的包括复方新诺明、氨苄西林以及四环素在内的抗生素有极其强的耐药性，而对于磺胺类药物和庆大霉素也有较强的耐药性，这与以往的一些报道相符。分离得到的菌株对头孢西丁、阿米卡星和磷霉素都比较敏感，故而建议首先选择这3种药治疗犬腹泻症。

分离得到的菌株表现出的耐药性比较严重，甚至有多重买药性的表现，有4株菌对超过10种以上的药都有耐药性，且有2株菌对本次试验选用的16种药都有耐药性，这应当引起广泛的重视。因为大肠杆菌自身带有耐药的质粒，而且这一质粒能够在菌体之间传递，故而菌株极容易对药物产生耐药性[4]。有学者研究发现诱发菌株的耐药谱多种多样的主要因素使宠物患病的时候不正确的用药观念和不合理的用药做法[5]。故而，在临床实践上要谨慎的用药，如果条件允许要先做药敏试验，以保证疾病得到治疗的同时避免细菌出现耐药性的概率以及减少其传递。■

（编辑：赵晓松）

[1]胡晓辰,孙艳敏,郭凤英,赵婷婷.犬源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].当代畜牧,2015,18(3):42-44.

[2]赵相胜,孙洋,纪雪,刘军,祝令伟,佟盼盼,冯书章.犬源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析[J].中国人兽共患病学报, 2014,30(3):268-272.

[3]崔耀明,宋笑颜,王玲飞,刘保光,田亚凯,胡功政.犬源大肠杆菌分离株对四环素类药物耐药性的检测[J].江西农业学报,2015,27(10):104-107.

[4]曹旭.浅谈犬腹泻的几种常见原因和防治[J].山东畜牧兽医,2015,36(12): 30-31.

[5]高新菊,侯羽浓,姚大伟,丁阳,杨德吉.犬致病性大肠杆菌的分离与鉴定[J].畜牧与兽医,2014,46(11):87-89.

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.12.044