石　冲　张国彬　张宇新　张作凤

(唐山市妇幼保健院遗传生殖科，河北　唐山　063000)



磷酸化ERK1/2对帕金森病模型小鼠黑质半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

石冲张国彬1张宇新1张作凤1

(唐山市妇幼保健院遗传生殖科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠黑质中半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的调控作用。方法建立PD小鼠模型，观察小鼠行为学变化；免疫组化和免疫印迹法检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)、caspase-3和p-ERK1/2的阳性细胞数和蛋白表达水平以及caspase-3酶活性改变，并观察给予p-ERK1/2特异性抑制剂U0126对上述变化的影响。结果与对照组相比，模型小鼠出现典型PD症状,TH蛋白水平下降约28.2%(P=0.009)，p-ERK1/2、caspase-3阳性细胞及蛋白水平显著增加(P<0.01)；经ERK1/2抑制剂U0126处理后，上述变化均显著减轻(P<0.01)。结论P-ERK1/2对MPTP诱导的PD小鼠黑质caspase-3表达可能有调控作用，U0126对PD小鼠具有一定的神经保护作用。

关键词〔〕帕金森病；MPTP；磷酸化ERK1/2；半胱氨酸蛋白酶-3；U0126

1河北联合大学研究生学院

第一作者：石冲(1981-)，女，主治医师，博士，主要从事神经退行性疾病发病机制研究。

帕金森病(PD)的病理特征为中脑黑质多巴胺(DA)能神经元进行性变性丢失，具体发病机制尚未明确〔1〕。研究表明PD病人和模型动物黑质区可见caspase-3激活介导的细胞凋亡〔2，3〕，PD小鼠敲除caspase-3基因明显减少黑质区DA能神经元丢失〔4〕，提示caspase-3在PD发病过程中可能起重要作用。阐述caspase-3的表达调控，利于揭示PD的发病机制。研究表明p-ERK1/2调控caspase-3激活〔5,6〕，类似机制是否存在于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)诱导PD模型小鼠DA能神经元丢失进程还不清楚。本实验观察PD小鼠模型中p-ERK1/2对中脑黑质区caspase-3表达和活性的影响，为PD的机制研究提供新思路。

1材料和方法

1.1动物采用北京维通利华公司实验动物中心C57BL/6N雄性小鼠30只，8～12周龄，25～30 g。自然光照，室温(25±2)℃，小鼠自由进食饮水，适应环境1 w后进行实验，所有动物操作均符合动物伦理委员会的有关规定。

1.2试剂MPTP(美国Sigma公司)，兔抗人caspase-3 mAb(福州迈新生物)，小鼠抗人TH mAb(美国Chemicon公司)，鼠抗人p-ERK mAb(美国Santa cruz公司)，p-ERK抑制剂U0126(德国Merk公司)，caspase-3荧光底物Ac-DEVD-AMC(美国Chemicon公司)，兔/鼠SP超敏试剂盒(福州迈新生物)。

1.3仪器设备组织切片机(Leitz 1512型，德国Leitz公司)，OLYMPUS光学显微镜(日本Olympus公司)，电子天平(JA-2003型，上海天平仪器厂)，低温离心机(TGL-16G-A型，上海安亭科学仪器厂)，图像分析系统(CMIAS，北京航空航天大学)，电泳仪(DYY-TB型，北京六一仪器厂)，半干式碳板转移电泳槽(DYY-Ⅲ40C型，北京六一仪器厂)。

1.4实验方法〔7〕

1.4.1动物分组小鼠随机分成三组，每组10次，模型组：0.3%MPTP(30 mg/kg)生理盐水配制并腹腔注射，1次/d。U0126组：MPTP注射前3 d腹腔预注射U0126(5 mg/kg,ip)，1次/d，连续3 d，每天注射MPTP前2～3 h注射1次U0126。对照组：注射与模型组等体积的生理盐水。注射药物后观察小鼠行为变化。各组均于第5次MPTP注射后6 h取脑。

1.4.2免疫组化MPTP第5次注射后6 h麻醉小鼠，经固定后每只小鼠取中脑3个相同断面行免疫组化染色。切片脱蜡后水浴法热修复，然后30 ml/L过氧化氢阻断内源过氧化物酶，非免疫动物血清室温孵育10 min。分别加入鼠抗人p-ERK1/2 mAb(1∶100)，兔抗人caspase-3 mAb(1∶100)4℃过夜。二抗室温孵育30 min，最后DAB显色并拍照分析。

1.4.3免疫印迹麻醉小鼠迅速断头取脑并分离中脑黑质，低温匀浆后静置30 min，高速离心后取上清备用。蛋白定量并在95℃水浴变性5 min。样品凝胶电泳结束后转膜，加入TH 单抗(1∶1 000)、caspase-3单抗(1∶400)和p-ERK1/2 单抗(1∶300)4℃过夜。抗血清(1∶200)室温孵育2 h，化学发光并曝光，扫描结果使用Image J软件。

1.4.4caspase-3酶活性测定模型制作成功后裂解组织提取蛋白并测蛋白浓度,调节蛋白浓度为1 μg/μl。100 μl体系中加入caspase-3特异性荧光底物Ac-DEVD-AMC，37℃避光孵育1 h。酶标仪检测荧光强度，激发光波长360 nm，发射光波长为460 nm。重复3孔并记录结果。

1.5图像分析免疫组化切片在CMIAS真彩色医学图像分析系统10×物镜下定位，计数阳性细胞数，每张脑片6个部位并计算均值。Image J软件分析平均光密度值以比较各组Western印迹蛋白的表达。

2结果

2.1行为学观察30只小鼠无死亡，均纳入结果分析。模型组小鼠MPTP注射后约20 min出现竖毛、尾过伸上翘、阵发性躯干震颤、易激惹、小便失禁、步态蹒跚等短暂的行为反应，随后出现自发性活动明显减少，次日略见恢复；U0126组小鼠与模型组相比PD特异性症状有所减轻。对照组小鼠活动一切如常。

2.2黑质区caspase-3及p-ERK免疫组化结果对照组偶见caspase-3阳性细胞，胞质着色浅；MPTP5次注射后6 h，caspase-3阳性细胞胞质着色很深。与模型组相比，U0126组阳性细胞数量明显减少，且胞质着色略变浅(P<0.01)。对照组仅见少量p-ERK胞质浅着色细胞；模型组6 h胞质、胞核均呈黄褐色p-ERK少量阳性细胞；与模型组相比，U0126组仅见细胞核染黄褐色，胞质着色略浅(P<0.01)。见图1，表1。

图1　中脑黑质区p-ERK1/2,caspase-3免疫组化染色(×200)

组别p-ERK1/2caspase-3对照组14.50±2.0710.83±2.64模型组54.33±3.931)45.67±1.511)U0126组29.50±1.872)32.50±2.432)

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

2.3Western印迹检测TH、caspase-3、p-ERK1/2蛋白结果分子量约Marker 61 000处,可见TH特异性蛋白条带。与对照组相比，MPTP模型组TH蛋白表达明显降约28.2%(P=0.009)。分子量约33 000处可见caspase-3特异性蛋白条带，模型组蛋白条带着色最深，U0126组同时间点与模型组相比条带较窄，染色较浅。经图像分析，差异有统计学意义(P<0.01)。对照组在约44 000和42 000分子量处可见p-ERK1/2特异性窄浅清晰蛋白条带，模型组蛋白条带着色略深，U0126组与模型组相比蛋白条带略浅。差异显著(P=0.002)，见图2，表2。

图2　中脑黑质区磷酸化p-ERK1/2、caspase-3 Western印迹结果

组别p-ERK1/2caspase-3TH对照组0.77±0.01540.61±0.0030.53±0.009模型组0.99±0.0031)0.99±0.0081)0.41±0.0111)U0126组0.84±0.0062)0.74±0.0072)0.47±0.0052)

2.4caspase-3酶活性结果模型组MPTP诱导的caspase-3酶活性极大增强(0.004 pmd/min)，使用p-ERK1/2上游激酶特异性抑制剂U0126后caspase-3活性有所抑制(0.003 pmol/min，P<0.05)。

3讨论

PD发病的临床表现有静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳、肌强直和步态障碍，病理特征为中脑黑质DA能神经元进行性变性缺失。本实验MPTP注射后小鼠出现震颤、竖毛、翘尾、活动减少等行为学特征，黑质区TH阳性神经元丢失严重〔7〕，提示PD模型成功复制。

研究表明PD发病与细胞凋亡关系密切〔8～11〕，凋亡途径中细胞膜表面的凋亡受体激活caspase-8，进而激活凋亡的最终执行者caspase-3。本实验模型组MPTP注射后黑质区出现大量caspase-3阳性细胞，其蛋白表达及caspase-3酶活性也明显升高，同时伴有黑质TH蛋白表达水平降低，提示caspase-3参与的凋亡反应可能是DA能神经元变性丢失的关键。

PD的发生发展涉及细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路。MAPK家族的主要成员ERK1/2是一种位于胞浆的蛋白激酶，一旦被激活,ERK1/2迅速穿过核膜并通过磷酸化反应调节某些转录因子的活性引起特定蛋白的表达或活性改变,最终影响细胞的生物学效应〔12〕。研究证实p-ERK1/2上游激酶特异性抑制剂可抑制Thrombin诱导的中脑黑质DA能神经元caspase-3表达〔5〕，提示caspase-3可能受p-ERK1/2调控。因此本实验分析了p-ERK1/2、caspase-3和TH在MPTP所致PD模型小鼠黑质区的表达情况，免疫组化结果发现模型组6 h p-ERK1/2出现明显核转位，而caspase-3此时有显著表达。U0126是ERK1/2信号通路的特异性抑制剂，研究表明它具有神经保护作用〔13〕。

本研究认为，MPTP可诱导中脑黑质p-ERK1/2分子激活，启动了caspase-3表达及凋亡反应,最终导致DA能神经元变性丢失；抑制剂U0126阻断了p-ERK1/2活化，使caspase-3表达减少，最终减轻了MPTP介导的DA能神经元损伤。总之，MPTP诱导的PD小鼠模型中，p-ERK1/2可能调控caspase-3表达，而抑制p-ERK1/2通路对DA能神经元可能具有神经保护作用。

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〔2014-06-19修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

中图分类号〔〕R745.7〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7046-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.035