罗小凤

(宜春学院医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，江西　宜春　336000)



P38MAPK抑制剂对皮瓣缺血再灌注损伤发展及TNF-α与IL-10表达的影响

罗小凤

(宜春学院医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，江西宜春336000)

摘要〔〕目的探讨P38MAPK抑制剂对皮瓣缺血再灌注损伤发展及肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-10表达的影响。方法选取48只12～14周龄的健康Wistar大鼠，并将其制作为大鼠腹部轴型浅动静脉皮瓣模型，按照随机数字表法将其均分为对照组、缺血再灌注组、生理盐水组和抑制剂组。术后第7天分别采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组大鼠的皮瓣存活率和血清TNF-α、IL-10浓度，同时采用免疫组织化学法检测各组大鼠皮瓣的P38MAPK和P-P38MAPK表达情况。结果①对照、抑制剂组大鼠皮瓣存活率高于缺血再灌注、生理盐水组(P<0.05)，对照、抑制剂组，缺血再灌注、生理盐水组之间皮瓣存活率均无统计学差异(P>0.05)；②对照、抑制剂组大鼠血清TNF-α浓度低于缺血再灌注、生理盐水两组(P<0.05)，对照、抑制剂组，缺血再灌注、生理盐水组之间血清TNF-α浓度比较无统计学差异(P>0.05)；抑制剂组大鼠血清IL-10浓度高于对照、缺血再灌注、生理盐水组(P<0.05)，缺血再灌注、生理盐水、抑制剂三组大鼠血清IL-10浓度无统计学差异(P>0.05)；③缺血再灌注、生理盐水、抑制剂组大鼠P38MAPK、P-P38MAPK评分高于对照组，而缺血再灌注、生理盐水组评分高于抑制剂组(P<0.05)；④皮瓣存活率与TNF-α呈负相关(r=-0.582，P<0.05)，P38MAPK、P-P38MAPK评分与TNF-α均呈正相关(r=0.608、0.775，P<0.05)，皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK评分与IL-10均无相关关系(P>0.05)。结论P38MAPK抑制剂通过抑制皮瓣中P38MAPK信号通路，减少P38MAPK和P-P38MAPK的表达，从而降低血清TNF-α的浓度，减轻缺血再灌注损伤，提高皮瓣的存活率。

关键词〔〕P38MAPK抑制剂；皮瓣；缺血再灌注损伤；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-10

第一作者：罗小凤(1976-)，女，硕士，讲师，主要从事人体解剖学方面的研究。

缺血再灌注损伤是导致皮瓣移植术后坏死的主要因素，也是目前器官、组织移植领域研究的热点〔1〕。随着丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在缺血再灌注损伤中的作用逐渐受到重视，越来越多的研究证实了P38MAPK信号通道在多种器官以及组织缺血再灌注损伤中发挥着不同的作用〔2〕。细胞因子作为组织炎症反应的重要标志物，激活的P38MAPK会促进其分泌和释放，进而参与缺血再灌注损伤的发生及发展〔3〕。SB202190作为一种P38MAPK抑制剂，它通过阻碍ATP与P38MAPK的结合，可以特异性地抑制P38MAPK信号通道的活性〔4〕。本研究旨在研究SB202190对皮瓣缺血再灌注损伤发展和脑瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10表达的影响，从而为缺血再灌注损伤的机制研究提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物选取48只健康Wistar雄性大鼠(苏州大学实验动物中心提供)，周龄12～14 w，体重250～350 g，未出现特定病原菌级(SPF级)。

1.2实验仪器、试剂

1.2.1仪器CT14RD-冷冻离心机(由天美公司生产提供)，酶联免疫检测仪器(Biotek公司生产)，-80℃超低温冰箱(Thermo公司生产)，BX51光学显微镜以及图像采集系统(Olympus公司生产)。

1.2.2试剂即用型快速免疫组化试剂盒(基因公司生产)，SB202190(Cayman公司)，在使用之前溶解并配制成0.1 mg/ml的溶液，大鼠TNF-α、IL-10酶联免疫测定试剂盒(R&D公司)，P38一抗、P-P38一抗(Abcam公司)。

1.3动物模型的建立及分组

1.3.1大鼠皮瓣模型的建立大鼠称重后注射2%的戊巴比妥钠(35～40 kg)进行麻醉，麻醉成功后将其固定在手术板上，在手术前进行腹部脱毛、消毒处理，随后参照有关文献〔5〕制作腹壁浅动静脉皮瓣。

1.3.2实验分组及处理方法按照随机数字表法将48只大鼠均分为四组，每组12只。对照组对建立的皮瓣模型不进行任何处理，只以3-0丝线对皮瓣切口进行原位缝合；缺血再灌注组在掀开大鼠皮瓣后，通过无损显微镜微血管夹将腹壁浅动静脉夹闭，缺血6 h后将血管夹取出，待腹部浅动静脉血流恢复正常后对皮瓣进行原位缝合；生理盐水组，在缺血再灌注组处理的基础上，于手术后的第2、4、6天向腹腔注射生理盐水(2 ml/kg)；抑制剂组，在缺血再灌注组处理的基础上，在手术后的第2、4、6天向腹腔注射SB202190(2 μg/kg)。

1.4观察指标手术后第7天测定各组大鼠以下指标：(1)皮瓣存活率：采用Image-Pro Plus.V6.0图像分析系统计算皮瓣的存活率，成活率=成活面积/总面积×100%。(2)血清TNF-α、IL-10浓度：采用酶联免疫测定法(ELISA)测定各组大鼠的血清TNF-α、IL-10浓度。(3)皮瓣P38MAPK的表达情况：采用免疫组化法测定各组大鼠皮瓣内的P38MAPK表达情况，并参照有关文献〔6〕对P38MAPK以及P-P38MAPK染色强弱以及阳性细胞数目进行评分：①染色强度计分：无为0，弱为1，中等为2，强为3；②阳性细胞数为含棕黄色颗粒的细胞数目占总细胞数目的比例，其中阳性细胞数目<25%计为1，阳性细胞数目25%～50%计为2，阳性细胞数目>50%计为3。

在进行房屋建筑施工过程中，通常都会遇到一些问题：①材料问题，现在的市场上建筑材料有好有坏，有些企业使用比较好的材料，建筑质量相应的也会更好，但是也有一些企业为了谋求更大的经济利益，他们往往会选择比较劣质的材料代替那些质量比较好但价格比较高的材料，这样情况下建设出来的房屋毋庸置疑是不好的。②施工时的天气状况，天气状况也会影响到施工质量，试想一下，如果在施工的当天下了雨，那么建筑的混凝土在掺了水的情况下质量就会大大下降，从而影响房屋质量。③地质状况，如果建筑选址选的不好，出现地基下沉的话，也会对建筑房屋的质量造成影响。

1.5统计学方法应用SPSS19.0软件，多组定量资料的比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，相关性分析采用Pearson积矩相关分析。

2结果

2.1四组大鼠的皮瓣存活率比较四组大鼠的皮瓣存活率经方差分析有统计学差异(F=8.732，P<0.05)；两两比较显示，对照〔(94.23±2.87)%〕、抑制剂组〔(87.71±2.99)%〕的皮瓣存活率高于缺血再灌注〔(55.82±3.36)%〕、生理盐水组〔(51.35±3.20)%〕(P<0.05)，对照、抑制剂两组之间的皮瓣存活率无统计学差异(P>0.05)，缺血再灌注、生理盐水两组之间的皮瓣存活率无统计学差异(P>0.05)。

2.2四组大鼠的血清TNF-α、IL-10浓度比较四组大鼠的血清TNF-α浓度经方差分析有统计学差异(F=12.038，P<0.05)；两两比较发现，对照、抑制剂组的血清TNF-α浓度〔(149.39±15.82)、(160.12±16.85)ng/L〕低于缺血再灌注、生理盐水两组〔(235.65±16.98)、(249.01±17.00)ng/L〕(P<0.05)，对照、抑制剂组，缺血再灌注、生理盐水组之间的血清TNF-α浓度比较无统计学差异(P>0.05)。四组大鼠的血清IL-10浓度经方差分析有统计学差异(F=10.167，P<0.05)，两两比较显示，抑制剂组〔(75.38±5.26)ng/L〕的血清IL-10浓度高于对照、缺血再灌注、生理盐水组〔(52.77±5.85)、(54.91±6.03)、(52.14±6.70)ng/L〕(P<0.05)，对照、缺血再灌注、生理盐水三组的血清IL-10浓度比较无统计学差异(P>0.05)。

2.3四组大鼠的P38MAPK、P-P38MAPK评分比较四组大鼠的P38MAPK、P-P38MAPK评分经方差分析有统计学差异(F=11.982、10.726，P<0.05)，两两比较发现，缺血再灌注、生理盐水、抑制剂组的P38MAPK、P-P38MAPK评分高于对照组，缺血再灌注、生理盐水组的P38MAPK、P-P38MAPK评分高于抑制剂组(P<0.05)。见表1。

组别nP38MAPK(分)P-P38MAPK(分)对照组122.26±0.931.23±0.57缺血再灌注组125.31±1.041)5.46±0.891)生理盐水组124.98±0.991)5.01±0.631)抑制剂组123.37±1.031)2)1.96±0.701)2)

与对照组比较:1)P<0.05;与缺血再灌注、生理盐水组比较:2)P<0.05

2.4皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK评分与TNF-α、IL-10浓度的相关性分析皮瓣存活率与TNF-α呈负相关关系(r=-0.582，P<0.05)，P38MAPK、P-P38MAPK评分与TNF-α均呈正相关关系(r=0.608、0.775，P<0.05)，皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK评分与IL-10均无相关关系(r=0.297、-0.137、-0.316,P>0.05)。

3讨论

现有研究表明细胞炎症因子是造成组织损伤的重要原因之一：释放的致炎性细胞因子增加血管的通透性及组织水肿，加重缺血损伤；同时，它还能经血液循环到远处，导致组织器官形态功能的损伤及障碍〔7，8〕。TNF-α作为一种重要的促炎症细胞因子，可与不同的炎症介质形成复杂的炎症反应网络系统，从而参与组织缺血再灌注损伤〔9〕，血清IL-10作用与TNF-α相反，它是一种抗炎性细胞因子，通过拮抗炎性细胞因子而发挥抗炎作用〔10〕。P38MAPK是介导细胞因子和组织炎症反应的重要细胞内信号转导途径，有研究证实它参与了缺血再灌注损伤的发生及发展过程，而P38MAPK抑制剂可通过抑制组织内P38MAPK的表达，减少炎性因子的生成，并最终抑制过度的炎性反应而减轻缺血再灌注损伤〔11〕。本研究结果显示，缺血再灌注损伤后大鼠皮瓣存活率降低，而P38MAPK抑制剂有助于减轻缺血再灌注损伤，与有关研究结果〔5〕相似。结果还表明，皮瓣缺血再灌注损伤增强了致炎性细胞因子的作用，加剧了组织的炎症损伤，而P38MAPK抑制剂减少了致炎性细胞因子的产生。此外，研究还显示，P38MAPK抑制剂可通过增加抗炎性细胞因子的浓度而减轻组织的炎症损伤，继而减轻皮瓣的缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤可能通过激活P38MAPK转导通路，促进P38MAPK和P-P38MAPK的表达来发挥作用〔4〕，而P38MAPK抑制剂通过抑制P38MAPK的作用可以减轻皮瓣的缺血再灌注损伤。进一步进行的相关性分析提示P38MAPK和P-P38MAPK的生成将促进TNF-α的产生，降低皮瓣缺血再灌注损伤的存活率。与有关研究结果〔5〕一致。但本次研究未发现皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK评分与IL-10存在相关性，原因可能与本研究选取的大鼠样本量较小有关。因此，在以后相关的研究中，建议增加样本量进行深入研究。

参考文献4

1Cheng HF，Feng Y，Jiang DM，etal.Protective function of tocilizumab in human cardiac myocytes ischemia reperfusion injury〔J〕.Asian Pac J Trop Med，2015；8(1)：48-52.

2Ashraf MI，Ebner M，Wallner C，etal.A p38MAPK/MK2 signaling pathway leading to redox stress，cell death and ischemia/reperfusion injury〔J〕.Cell Commun Signal，2014；12(1)：6.

4Grossi V，Liuzzi M，Murzilli S，etal.Sorafenib inhibits p38α activity in colorectal cancer cells and synergizes with the DFG-in inhibitor SB202190 to increase apoptotic response〔J〕.Cancer Biol Ther，2012；13(14)：1471-81.

5吴建龙，巨积辉，周广良，等.SB202190对皮瓣缺血再灌注损伤时TNF-α和IL-10影响的实验研究〔J〕.中国临床解剖学杂志，2014；32(6)：698-703，707.

6Manson PN，Anthenelli RM，Im MJ,etal.The role of oxygen-free radicals in ischemia tissue injury in island skin flaps〔J〕.Ann Surg，1983；198(1)：87-90.

7闫文翠，王晶，张维娜，等.生黄合剂对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(23)：5893-5.

8赵京禹，费翔，郭徽，等.右美托咪定预处理对小鼠肠缺血再灌注损伤的作用研究〔J〕.现代生物医学进展，2014；14(35)：6823-6.

9Pei H，Song X，Peng C，etal.TNF-α inhibitor protects against myocardial ischemia/reperfusion injury via Notch1-mediated suppression of oxidative/nitrative stress〔J〕.Free Radic Biol Med，2015；82(2)：114-21.

10Sutter AG，Palanisamy AP，Ellet JD，etal.Intereukin-10 and Kupffer cells protect steatotic mice livers from ischemia-reperfusion injury〔J〕.Eur Cytokine Netw，2014；25(4)：69-76.

11刘流，周海洋，冉珂，等.p38MAPK信号通路在甘草酸二铵减轻兔心肌缺血再灌注损伤中的作用〔J〕.南方医科大学学报，2010；30(2)：298-300.

〔2015-01-19修回〕

(编辑袁左鸣)

中图分类号〔〕R62〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7044-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.034