芮丹云　唐丽媛　陈　洁　邹天南

(昆明学院医学院，云南　昆明　650214)



补肾活血颗粒对骨质疏松大鼠骨组织中OPG/RANKL mRNA及蛋白表达的影响

芮丹云唐丽媛陈洁1邹天南1

(昆明学院医学院，云南昆明650214)

摘要〔〕目的探讨补肾活血颗粒对骨质疏松(OP)大鼠骨组织中骨保护蛋白/核因子-β受体活化因子配体(OPG/RANKL)mRNA及蛋白表达的影响。方法采用卵巢摘除法建立SD大鼠OP模型。分别给予生理盐水(模型组)、50 mg/kg补肾活血颗粒(低剂量组)、100 mg/kg补肾活血颗粒(中剂量组)、200 mg/kg补肾活血颗粒(高剂量组)、30 μg/kg 17β-雌二醇(雌激素组)干预治疗12 w，设立假手术组为对照。比较各组骨密度(BMD)、骨组织中OPG/RANKL mRNA及蛋白表达水平。结果与假手术组比较，模型组大鼠BMD、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达显著减低(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组及雌激素组BMD、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达明显提高(P<0.05)。高剂量组BMD、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达显著高于低、中剂量组及雌激素组(P<0.05)。结论补肾活血颗粒可有效改善OP大鼠骨密度，调节OPG/RANKL可能是其作用机制。

关键词〔〕补肾活血颗粒；骨质疏松；OPG；RANKL

1云南省第一人民医院

第一作者：芮丹云(1981-)，男，讲师，在读硕士，主要从事分子生物学方面的研究。

老年人是骨质疏松(OP)的高发人群，发生率逐年递增，骨折风险大大增加〔1〕。中医理论认为，肾虚、血瘀是诱发OP的主要病机，故补肾化瘀原则应贯穿OP治疗始终〔2〕。补肾活血颗粒具有补肾壮阳，调气活血之功效。补肾活血颗粒治疗OP的临床疗效已得到公认，但其作用机制尚未明确〔3〕。骨保护蛋白(OPG)/核因子-β受体活化因子配体(RANKL)信号通路是近年来发现的参与骨重建的重要途径之一，其在OP的发生与发展过程中发挥重要作用〔4〕。本研究旨在为OP症的基础研究及补肾活血颗粒的推广应用提供可靠依据。

1材料与方法

1.1仪器与试剂补肾活血颗粒OPG/RANKL引物(上海生工)；OPG/RANKL抗体、DNA marker DL2000(Takara公司)；PCR仪、RNA PCR Kit(ABI公司)；WB显影剂(南京建成生物有限公司)。

1.2实验动物及分组选取48只雌性SPF级SD大鼠，体重310～370 g，8月龄，按随机数字表法将大鼠分为6组，每组8只，即假手术组、模型组、补肾活血颗粒低剂量组(简称低剂量组)、补肾活血颗粒中剂量组(简称中剂量组)、补肾活血颗粒高剂量组(简称高剂量组)、雌激素治疗组(简称雌激素组)。

1.3实验方法

1.3.1OP模型建立1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，假手术组：沿大鼠背侧后方髂骨嵴上方约2 cm、脊柱旁约1 cm处做一纵形切口，暴露卵巢并将其轻轻提起，卵巢复位，逐层关闭腹腔。模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、雌激素组：以同样方法暴露双侧卵巢，并行手术切除，丝线结扎残端，逐层关闭腹腔。

1.3.2给药方式各组大鼠术后均给予抗感染治疗。术后正常喂养2 w，之后给予连续药物干预。假手术组、模型组：每日给予2 ml生理盐水灌胃，1次/d。低、中、高剂量组：每日分别给予2 ml补肾活血颗粒(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)灌胃，1次/d。雌激素组：每日给予17β-雌二醇(30 μg/kg)皮下注射，1次/d。连续干预12 w。

1.3.3骨密度(BMD)检测处死大鼠，取右侧完整股骨标本，采用双能X线BMD测量仪测定股骨全长BMD(tBMD)。

1.3.4组织病理学检测选取股骨标本节段，生理盐水反复冲洗，10%中性甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)脱钙处理，分别使用以下浓度的酒精并按顺序进行脱水：30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%(I)→100%(Ⅱ)，取出组织，放入二甲苯与无水酒精混合溶液中浸泡1 h，取出后放入纯二甲苯中浸泡20 min，纵向石蜡包埋，已经包埋好的蜡块取出，修整后安装于持蜡器上，切片机一次性连续切片8张，切片厚度约为4～6 μm，常规苏木素-伊红(HE)染色，封片，镜下观察。

1.3.5OPG/RANKL mRNA检测采用RT-PCR检测骨组织中OPG/RANKL mRNA表达。操作TRIZOL试剂盒说明书提取骨组织总RNA，将RNA反转录为cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增引物序列见表1，以还原型辅酶Ⅱ(GAPDH)为内参。

表1PCR引物序列

引物序列片段长度OPG上游5'-TCCTGGCACCTACCTAATACAGCA-3'117bp下游5'-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3'RANKL上游5'-AGCCTTTCAAGGGGCCGTGC-3'104bp下游5'-GGGCCACATCGAGCCACGAA-3'GAPDH上游5'-TAAAGGGCATCCTGGGTACACT-3'199bp下游5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3'

1.3.6OPG/RANKL蛋白检测采用Western印迹法检测骨组织中OPG/RANKL蛋白表达水平。常规提取骨组织总蛋白，定量测试盒测定总蛋白浓度，按4∶1比例分别加入5倍上样缓冲液和蛋白样品，煮沸3min，配制聚丙烯酰胺凝胶，上样，跑胶1.5 h，0℃ 100 V转膜1 h，5%脱脂乳室温封闭1.5 h，FOXO1抗体稀释1 000倍后4℃孵育过夜，洗膜3次，二抗孵育2 h，增强化学发光法(ECL)试剂显色，后用软件进行蛋白表达定量分析。

1.4统计学方法应用SPSS18.0软件进行单因素方差检验。

2结果

2.1骨组织切片结果假手术组骨小梁结构正常，骨皮质致密均一；模型组骨小梁结构发生改变骨皮质结构疏松、变薄；高剂量组骨小梁略有变薄，但排列较为整齐，且可连接成网，其密度尚为正常。见图1。

图1　股骨组织切片

2.2BMD与假手术组〔(0.199±0.005)mg/cm3〕比较，模型组〔(0.183±0.006)ng/cm3〕大鼠股骨全长BMD显著减低(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组及雌激素组BMD〔(0.189±0.004)mg/cm3,(0.194±0.005)mg/cm3,(0.199±0.003)mg/cm3,(0.192±0.004)mg/cm3〕明显提高(P<0.05)。高剂量组BMD显著高于低、中剂量组及雌激素组(P<0.05)。

2.3OPG/RANKL mRNA与假手术组相比较，模型组OPG mRNA、RANKL mRNA显著减低(P<0.05)。与模型组相比较，低、中、高剂量组及雌激素组OPG mRNA、RANKL mRNA明显提高(P<0.05)。高剂量组OPG mRNA、RANKL mRNA显著高于低、中剂量组及雌激素组(P<0.05)。见表2。

组别OPGRANKL假手术组0.725±0.0111)0.978±0.0311)模型组0.412±0.0120.485±0.022低剂量组0.548±0.0181)2)0.592±0.0151)2)中剂量组0.604±0.0251)2)0.604±0.0281)2)高剂量组0.683±0.0131)0.717±0.0421)雌激素组0.662±0.0141)2)0.594±0.0351)2)

与模型组比较：1)P<0.05；与高剂量组比较：2)P<0.05；下表同

2.4OPG/RANKL蛋白表达与假手术组比较，模型组OPG、RANKL蛋白表达显著减低(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组及雌激素组OPG、RANKL蛋白表达明显提高(P<0.05)。高剂量组OPG、RANKL蛋白表达显著高于低、中剂量组及雌激素组(P<0.05)。见表3，图2。

组别OPGRANKL假手术组0.613±0.0531)0.923±0.0311)模型组0.137±0.0110.385±0.022低剂量组0.287±0.0421)2)0.492±0.0151)2)中剂量组0.464±0.0361)2)0.604±0.0281)2)高剂量组0.589±0.0331)0.717±0.0421)雌激素组0.492±0.0511)2)0.584±0.0351)2)

1：假手术组；2：模型组；3：低剂量组；4：中剂量组；5：高剂量组；6：雌激素组图2　各组OPG/RANKL 蛋白表达水平比较

3讨论

正常生理状态下，人体内成骨细胞(OB)骨质沉积于破骨细胞(OC)骨质吸收处于动态平衡。病理状态下，骨重建率大大提高，由于骨形成周期明显长于骨吸收周期，故新骨形成速度远远低于旧骨吸收速度，从而导致骨丢失，进而引发包括OP在内的多种骨代谢疾病。因此，调控骨重建、抑制骨吸收已成为防治OP的重要策略。近年来研究证实，OPG/RANKL系统与骨重建过程密切相关〔5〕。OPG属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，主要由OB细胞分泌，并以二聚体形式存在〔6〕。RANKL属于TNF配体超家族成员，具有促进OC分化，阻值OC凋亡等作用〔7〕。OPG可通过竞争性地与三聚体RANKL相结合，阻断RANKL与核因子-κβ受体活化因子(RANK)结合，从而抑制OC前体活化及成熟OC活化，降低骨吸收活性，诱导OC凋亡〔8〕。骨组织中OPG/RANKL比例变化可直接影响OC生成、BMD及骨强度，并最终诱发OP〔9〕。

祖国医学认为OP属于“骨痹”、“骨萎”范畴，气血阻滞、肾精亏虚是其主要病机，故用药应以补肾活血方剂为主〔10〕。补肾活血方是中医临床治疗OP的经典方剂〔11〕。全方由熟地、肉桂、杜仲、山药、附子、枸杞、甘草、红花、山茱萸组成。既往基础研究证实，补肾活血颗粒可显著提高去势大鼠血清雌激素水平，促进骨形成，抑制骨吸收，增加BMD，提高骨组织力学性能，从而达到预防去势大鼠OP的作用〔12〕。但补肾活血颗粒治疗OP的作用机制尚未完全明确。本研究结果证实OPG/RANKL系统在维持股骨头BMD中发挥重要作用。采用补肾活血颗粒与雌激素进行干预治疗，均可有效上调骨组织中OPG/RANKL mRNA及蛋白表达。本研究结果显示，切除大鼠双侧卵巢后，大鼠BMD明显降低，提示采用卵巢摘除法可成功建立OP模型。而采用补肾活血颗粒进行干预治疗，可有效拮抗去势所致的BMD降低现象，且其拮抗作用呈明显剂量依赖性，100 mg/kg补肾活血颗粒干预治疗即可获得与雌激素相当的干预效果，200 mg/kg补肾活血颗粒干预治疗效果优于雌激素治疗，分析其原因可能与补肾活血颗粒可明显促进骨组织中OPG/RANKL mRNA及蛋白表达有关，OPG/RANKL表达上调有利于抑制破骨性骨吸收，增加BMD，从而发挥防治OP的效果。

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〔2015-03-17修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：邹天南(1967-)，男，副主任医师，主要从事脊柱外科、骨质疏松方面的研究。

中图分类号〔〕R68〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7036-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.030