张　妍　郭荣年　孙柳青　靳俊峰　吴秀香

(遵义医学院珠海校区病理学与病理生理学教研室，广东　珠海　519090)



葡萄籽原花青素对肾血管性高血压大鼠动态血压、白细胞介素-18和白细胞介素-10水平的影响

张妍郭荣年孙柳青靳俊峰吴秀香

(遵义医学院珠海校区病理学与病理生理学教研室，广东珠海519090)

摘要〔〕目的探讨葡萄籽原花青素(GSP)对肾血管性高血压(RH)大鼠动态血压、血清白细胞介素(IL)-18和IL-10水平和腹主动脉、肾皮质和海马组织中IL-10蛋白表达的影响。方法采用两肾一夹(2K1C)法，建立RH大鼠模型，并设立假手术组(n=7)。术后2 w，选取鼠尾动脉收缩压(SBP)超过130 mmHg的大鼠28只为RH大鼠，并随机分为4组(n=7)：模型组；低剂量GSP组(50 mg·kg-1·d-1)；高剂量GSP组(200 mg·kg-1·d-1)及卡托普利组(30 mg·kg-1·d-1)。观察各组大鼠尾动脉SBP的动态变化，治疗6 w后，采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-18和IL-10含量，Western印迹法检测各组大鼠腹主动脉、肾皮质及海马组织中IL-10蛋白表达水平。结果与模型组相比，用GSP治疗2 w即可使RH大鼠尾动脉SBP降低(P<0.05，P<0.01)，用药6 w后降压效果更明显(P<0.05，P<0.01)。同时亦能显著增高RH大鼠血清IL-10含量和腹主动脉、肾皮质及海马组织IL-10蛋白表达水平，降低RH大鼠血清IL-18含量，其中以高剂量GSP组作用尤为明显(P<0.01)，与卡托普利组的作用相当(P>0.05)。结论GSP可以部分通过增加RH大鼠体内抗炎因子IL-10的生成，减少促炎因子IL-18的产生而发挥抗炎和降压作用。

关键词〔〕葡萄籽原花青素；肾血管性高血压；白细胞介素-18；白细胞介素-10

第一作者：张妍(1986-)，女，硕士，主要从事高血压新药开发研究。

高血压是一种慢性低级别炎症性疾病〔1,2〕，从高血压的发生至靶器官受到损害，均与炎症，特别是促炎因子如C-反应蛋白，肿瘤坏死因子(TNF)-α等的产生增多〔3～5〕、抗炎因子如白细胞介素(IL)-10的产生减少有关〔6〕。是否可以通过抗感染治疗辅助降压，减轻高血压对心脑血管等器官的损伤成为临床研究热点。研究表明，葡萄籽原花青素(GSP)，一种从葡萄籽中提取的多酚化合物，具有抗炎、保护心血管等多种药理作用〔7,8〕。本研究观察GSP对大鼠肾血管性高血压(RH)的抗炎和降压作用。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器GSP由天津尖峰天然产物研究开发有限公司惠赠，其纯度≥95%，批号：1010014-27，大鼠试验50 mg/kg、200 mg/kg；卡托普利为中美上海施贵宝制药有限公司产品，批号：1007031，大鼠试验30 mg/kg。SPF级雄性SD大鼠50只，体质量180～200 g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2008-0002；合格证号：0073204。IL-18和IL-10 ELISA试剂盒为美国R&D systems有限公司产品，兔抗鼠IL-10抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔Ⅱ抗为武汉博士德生物工程有限公司产品，蛋白分子量标准为美国MBI公司产品，BCA蛋白定量试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；大鼠尾动脉收缩压(SBP)测定装置和RM6420型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)。

1.2RH大鼠模型复制及RH大鼠筛选50只SD大鼠测量基础尾动脉SBP后，随机分出7只为假手术组，剩余43只为手术组，按照先前方法复制RH大鼠模型〔7〕。术后2 w选取鼠尾动脉SBP(每周测量，连续测量3次，取其平均值)≥130 mmHg的大鼠28只，为复制成功的RH大鼠，进入本研究。

1.3动物分组及给药复制成功的28只RH大鼠，随机分为4组：模型组，低剂量GSP组，高剂量GSP组及卡托普利组，每组7只。治疗各组大鼠每天灌胃给药1次，给药剂量分别为GSP 50、200 mg/kg；卡托普利30 mg/kg；假手术组和模型组，则每天灌胃以相同体积的蒸馏水，连续灌胃治疗6 w。

1.4大鼠尾动脉SBP的测定采用无创鼠尾动脉测压装置及多道生理信号采集处理系统，分别于用药后2 w、4 w和6 w测定各组大鼠的尾动脉SBP，每次测量3次，取其平均值。测压时保持大鼠尾部的温度适宜(采用间断加温，以大鼠保持安静状态和尾动脉有搏动信号为佳)。

1.5大鼠血清IL-18和IL-10含量测定灌胃6 w后，乙醚麻醉大鼠，摘眼球取血，室温下静置4 h，吸取血清，严格按照ELISA试剂盒说明书加样操作。

1.6总蛋白的提取和Western印迹法检测IL-10蛋白表达取大鼠腹主动脉、肾皮质及海马组织，按照质量体积比1∶9加入匀浆液(其中含有组织蛋白抽提液及多种蛋白酶抑制剂)分别进行匀浆，制备成10%组织匀浆液，分别加入等体积的2倍上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性，低温离心(4℃ 12 000 r/min)5 min后，分别取上清液，BCA法测定各组样本的蛋白浓度，用上样缓冲液调整蛋白的浓度，使各泳道的蛋白上样体积为10 μl，且使其中含蛋白浓度为20 μg。进行聚丙烯胺凝胶电泳，随后转印至硝酸纤维膜(NC膜)上，经脱脂奶粉封闭、洗脱后加IL-10抗体(1∶300)，4℃孵育过夜，再分别加入相应Ⅱ抗(1∶2 500)，摇床孵育80 min。洗脱后，加ECL发光显示剂，暗盒压片、曝光，显影、定影于胶片上。胶片经照相后，用Bio-Rad提供的Quantity One 软件进行灰度值分析，以实验各组大鼠蛋白条带平均灰度值与同一样品中内参蛋白条带的平均灰度值比值作为IL-10蛋白的相对含量。

1.7统计学方法采用SPSS17.0软件行方差分析及LSD-t检验。

2结果

2.1GSP对RH大鼠尾动脉SBP的影响在GSP治疗过程中，与假手术组相比，模型组大鼠尾动脉SBP一直明显升高(P<0.01)。与模型组相比，GSP组从用药2 w开始即可使高血压大鼠尾动脉SBP降低，用药后6 w且高剂量GSP组降压效果更明显(P<0.01)，与卡托普利的降压效果相当，与假手术组无差异(P>0.05)。见表1。

2.2GSP对RH大鼠血清IL-18、IL-10含量影响灌胃6 w后，与假手术组相比，模型组大鼠血清IL-18含量显著升高(P<0.01)，而IL-10含量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，高剂量GSP组大鼠血清IL-18含量明显降低(P<0.01)，而IL-10含量明显升高(P<0.01)；低剂量GSP组IL-18或IL-10含量也有降低或升高，但无显著差异(P>0.05)。见表2。

2.3GSP对RH大鼠腹主动脉、肾皮质及海马组织中IL-10蛋白表达的影响表3，图1可见，经灌胃治疗6 w后，与假手术组相比，模型组大鼠腹主动脉、肾皮质及海马组织中IL-10蛋白表达明显降低(P<0.01)；与模型组相比，低及高剂量GSP组大鼠上述组织中IL-10蛋白表达明显升高(P<0.05)，其中，以高剂量GSP组的降低作用尤为显著(P<0.01)，与卡托普利组作用相当，与假手术组相比无差异(P>0.05)。

组别用药前用药后2w用药后4w用药后6w假手术组95.08±2.8793.44±1.5394.54±1.8395.55±3.43模型组158.07±5.341)155.16±4.141)158.84±4.391)154.49±6.441)低剂量GSP组156.16±3.06150.21±2.552)142.21±5.612)136.08±4.622)高剂量GSP组159.59±2.96142.61±5.223)124.11±1.743)106.86±2.203)卡托普利组155.49±5.61141.15±3.993)122.53±2.633)105.40±2.863)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

组别IL-18IL-10假手术组12.855±3.29615.692±3.573高血压模型组28.384±5.7391)6.764±2.2441)低剂量GSP组25.711±5.0889.452±2.966高剂量GSP组19.152±3.5443)12.785±3.6733)卡托普利组19.425±2.0523)11.839±4.7743)

A：腹主动脉；B：肾皮质；C：海马；D：内参；1：假手术组；2：模型组；3：低剂量GSP组；4：高剂量GSP组；5：卡托普利组图1　Western印迹检测各组大鼠不同组织中IL-10蛋白水平

组别腹主动脉肾皮质海马假手术组0.354±0.01470.101±0.00420.295±0.0123模型组0.185±0.01531)0.054±0.00451)0.142±0.00511)低剂量GSP组0.212±0.01723)0.061±0.00502)0.170±0.01382)高剂量GSP组0.327±0.01073)0.105±0.00303)0.242±0.00803)卡托普利组0.321±0.01433)0.094±0.00423)0.229±0.01023)

3讨论

本实验结果显示，RH大鼠模型复制成功。同时其血清IL-18含量亦显著升高，IL-10含量明显降低，证实RH时，体内有炎症反应的参与，与李丽娟等〔6〕的研究结果一致。IL-18是由活化的单核-巨噬等炎症细胞产生的一个重要的促炎因子，其与高血压等心血管疾病的发生发展关系密切〔9,10〕。血清中促炎介质IL-18的增多，可以通过诱生IFN-γ，激活免疫细胞，促进血管内皮细胞表达MHC-Ⅱ类抗原的细胞因子，使血管内皮产生舒血管物质减少，缩血管物质增多，最终使血管收缩，血压升高。同时，IL-18能促进血管平滑肌细胞增生，使血管壁增厚，管腔狭窄从而升高血压〔11〕。IL-10是主要由单核和T淋巴细胞产生的一种抗炎因子，可以通过抑制TNF-α等炎症因子产生〔12〕、减弱NADPH氧化酶的活性使阻力血管内皮依赖性舒张反应增强〔13〕，发挥保护血管内皮的作用。RH时，大鼠血清中IL-10含量降低，致上述作用减弱，从而促进高血压的发生。本文结果表明，GSP降压的机制可能与其具有减少RH大鼠血清中促炎介质IL-18生成，增加抗炎因子IL-10的产生的作用有关。最近研究表明，炎症反应不仅参与了高血压的发生，而且与高血压靶器官的损害关系密切，会使心血管、肾脏及脑等多组织发生慢性炎症反应〔14〕。本实验结果表明GSP可以通过增加抗炎介质IL-10的生成，减轻炎症反应，发挥保护高血压靶器官损害的作用。2010年有研究发现，给予外源性抗炎因子IL-10，可使怀孕诱发的高血压大鼠的血压和内皮功能恢复正常〔15〕，提示，在高血压的治疗中，增强抗炎因子的作用不容忽视。本研究结果为高血压的抗炎治疗提供了一个新的候选者。

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〔2014-03-11修回〕

(编辑曹梦园)

通讯作者：吴秀香(1964-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事高血压的发病机制及其防治研究。

基金项目：贵州省科技厅资助项目(黔科合J字〔2008〕2317)；贵州省高层次人才科研条件特助经费资助项目(TZJF-2008年58号)

中图分类号〔〕R544.14；R282.71〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7018-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.023