王玮瑶　沈　楠　张以忠　郑中华　金　宏　刘　威　齐　玲　于洪泉

(吉林医药学院基础医学院，吉林　吉林　132013)



环磷酰胺对胶质瘤体内生长的影响

王玮瑶沈楠张以忠郑中华金宏刘威齐玲于洪泉1

(吉林医药学院基础医学院，吉林吉林132013)

摘要〔〕目的探讨环磷酰胺(CTX)对胶质瘤体内生长的影响及其机制。方法建立Wistar大鼠胶质瘤模型，将其分为对照组(生理盐水腹腔注射)和给药组(CTX腹腔注射25 mg/kg)，观察大鼠一般状态、体重的变化，检测肿瘤体积和重量变化，计算抑瘤率。Western印迹检测肿瘤组织中细胞周期蛋白(cyclin)D1蛋白的表达。结果给药组大鼠的一般状态较好，大鼠体重恢复；给药组肿瘤的体积缩小、重量降低，给药10 d时与对照组比较，有统计学意义(P<0.05)，计算其体积抑瘤率为38.59%。Western印迹显示，给药组表达cyclin D1蛋白减少，与对照组比较，有统计学意义(P<0.05)。结论CTX通过调控细胞周期蛋白cyclin D1来抑制胶质瘤的体内生长。

关键词〔〕环磷酰胺；胶质瘤；生长；cyclinD1

1吉林大学第一医院神经外科

于洪泉(1974-)，男，副主任医师，医学博士，主要从事脑肿瘤研究。

第一作者：王玮瑶(1986-)，女，硕士，主要从事脑肿瘤药物研究。

在全身肿瘤中脑肿瘤发病率虽然很低，但是以恶性为主，恶性脑肿瘤中又以胶质瘤最为常见，并且由于位于颅内，对患者健康和生命的影响极大。临床上常用手术联合放化疗等多种治疗方法，但疗效差〔1，2〕。环磷酰胺(CTX)是临床上常用的化疗药物之一，但其对胶质瘤的单独作用还未见相关报道。本实验研究CTX对胶质瘤体内生长的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1药品CTX(美国Sigma公司)。Bradford蛋白浓度测定试剂盒(美国Pierce公司)；β-actin和细胞周期蛋白(cyclin)D1抗体(美国Santa Cruz公司)。J-26XP超低温高速离心机(美国贝克曼公司)；DNA蛋白电泳系统(美国Bio-Rad公司)；Image-Pro Plus 图像分析管理系统(Media Cybernetics公司)。

1.2动物雄性Wistar大鼠20只，购自吉林大学实验动物中心〔动物合格证号SCXK(吉)2008-0005〕，体重220～240 g。

1.3细胞培养及接种大鼠C6胶质瘤细胞株，由吉林医药学院中心实验室提供，置于含10%小牛血清的1640培养液中进行培养，待细胞生长至对数期，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后制成细胞悬液，细胞浓度2×108/ml，台盼蓝染色检测活细胞数超过95%，收集细胞后将其置于冰上。

1.4动物分组及造模〔3〕将实验大鼠随机分为两组，每组10只。于右股皮下接种100 μl含2×106个细胞的混悬液。术后观察大鼠肿瘤生长情况及一般状态。术后第3天，腹腔注射给药，连续处理10 d。操作均在每日的下午同一时间进行。

1.5Wistar大鼠体重变化测量不同时期两组大鼠的体重，计算各个阶段大鼠体重的平均值。

1.6测算肿瘤重量和体积抑瘤率〔4〕给药后的第10天处死大鼠，取出完整的肿瘤组织，检测肿瘤的重量及大小，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100%。测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的体积。肿瘤体积=短径2×长径/2。

1.7Western印迹检测cyclin D1蛋白PBS洗涤细胞，50 μl细胞裂解液充分裂解细胞，4℃ 离心15 min，取上清测定样品蛋白浓度，SDS-PAGE胶分离样品，转膜封闭，加入β-actin、cyclin D1抗体，4℃孵育过夜。二抗室温孵育1 h，胶片曝光拍照。采用Image-Pro Plus图像分析管理系统分析，以特异性条带平均吸光度与面积的乘积，反映蛋白表达水平。

1.8统计学处理采用SSPS17.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2结果

2.1大鼠的一般状态造模前大鼠进食均正常，身上毛发光泽柔顺，活泼好动。造模后3 d大多数大鼠均可触及肿瘤。给药3 d时大鼠进食减少，行动开始迟缓，毛发光泽度差。给药7 d时对照组大鼠消瘦，脱毛加重，甚至出现颤抖；给药组大鼠进食开始增加，脱毛现象减轻，一般状态好转。给药10 d时，对照组大鼠状态极差；而给药组大鼠已逐渐恢复正常。

2.2CTX对胶质瘤大鼠体重的影响造模前、给药当天和给药3 d时两组大鼠体重相近；给药7、10 d时，对照组大鼠体重逐渐减轻，而给药组大鼠体重开始恢复；与对照组比较，给药10 d时给药组大鼠体重明显增加(P>0.05)。见表1。

2.3CTX对大鼠胶质瘤体积与重量的影响给药组肿瘤体积减小〔(33.33±18.63)mm3〕、肿瘤重量减轻〔(2.00±2.23)mg〕，与对照组比较〔(54.27±46.43)mm3,(11.20±11.58)mg〕有统计学意义(P<0.05)，其体积抑瘤率为38.59%。

2.4CTX对肿瘤组织cyclin D1表达的影响与对照组(6.53±0.87)比较，给药组cyclin D1蛋白(3.03±1.10)明显降低(P<0.05)。

时间对照组给药组造模前1d225.25±18.58229.83±13.78给药当天230.90±19.47238.11±14.01给药3d230.44±23.42232.21±14.79给药7d217.31±24.32225.17±13.09给药10d215.98±27.53228.23±14.761)

与对照组比较：1)P<0.05

3讨论

CTX是细胞周期非特异性抗肿瘤药物，单独作用时并无抗肿瘤活性，当进入体内后，会在肝脏内经氧化作用转化成一过性的醛磷酰胺〔5〕，而后继续在肿瘤细胞内再分解成有毒性作用的酰胺氮芥及丙烯醛。作为烷化剂类抗肿瘤药物CTX可以干扰肿瘤细胞的DNA及RNA功能，从而影响肿瘤细胞的生长，最终达到抗肿瘤的作用〔6〕。本研究说明，CTX可以抑制恶性胶质瘤的体内生长，并且可以改善机体的一般状态。

CTX发挥作用时主要作用于细胞周期的S期，发挥细胞调控作用。细胞的生长受cyclins和cyclin依赖性激酶抑制因子的调控，其中cyclin D1对细胞的生长起到正向调节的作用，并且主要作用于S期。在多种恶性肿瘤组织中均有cyclin D1蛋白表达增加，说明其过度表达是多种人类原发性肿瘤的特征，对肿瘤的诊断和预后判断具有重要意义〔7，8〕。本实验结果说明，CTX可以通过抑制周期蛋白cyclin D1起到抑制肿瘤生长的作用，但更多的机制还需要进一步验证。

参考文献4

1齐玲，金宏，赵东海，等.五味子木脂素诱导胶质瘤神经球细胞凋亡的机制研究〔J〕.中国药学杂志，2014；49(2)：113-6.

2钟越，齐玲，沈楠，等.越桔原花青素调控脑胶质瘤细胞生长的机制研究〔J〕.中国病理生理杂志，2014；30(4)：603-8.

3王晓刚，魏学忠，周定标.Wistar 大鼠C6胶质瘤动物模型的肿瘤生长特点〔J〕.军医进修学院学报，2001；22(4)：300-2.

4金岳雷，范晓艳，吕冬霞，等.五味子乙素对H22荷瘤小鼠抑制作用的病理学研究〔J〕.黑龙江医药科学，2008；31(5)：7-8.

5王冠，黄楹，冯珂珂，等.AV-AS 联合环磷酰胺治疗大鼠皮下胶质瘤效果观察〔J〕.山东医药，2011；51(2)：10-2.

6问明，马振峰，张卓奇，等.环磷酰胺对肿瘤微环境调节作用的研究〔J〕.河北医药，2014；36(13)：1942-5.

7Rekhi B，Motghare P.Cyclin D1 and p16INK4 positive endometrial stromal sarcoma：a case report with new insights〔J〕.Indian J Pathol Microbiol，2014；57(4)：606-8.

8Qu DW，Xu HS，Han XJ，etal.Expression of cyclinD1 and Ki-67 proteins in gliomas and its clinical significance〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014；18(4)：516-9.

〔2015-08-26修回〕

(编辑曲莉/滕欣航)

通讯作者：齐玲(1974-)，女，副教授，医学博士，主要从事脑肿瘤药物研究。

基金项目：吉林省科技厅项目(20140414049GH)；吉林省卫生厅项目(2014Z104)

中图分类号〔〕R282.7〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7011-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.020