陈国平　范平明　夏立平　刘晓力　郑武平　李京泰　陈峙霖　吕鹏飞

(海南医学院附属医院,海南　海口　570102)



Smad4、TGF-β1、TGF-βR1表达与乳腺癌细胞恶性程度的相关性

陈国平范平明夏立平刘晓力1郑武平李京泰陈峙霖吕鹏飞

(海南医学院附属医院,海南海口570102)

摘要〔〕目的探讨乳腺癌细胞株与乳腺癌临床标本中Smad4及转化生长因子(TGF)-β1、TGF-β受体(R)1的蛋白表达水平与乳腺癌发生、发展、转移等生物学行为及预后的相关性。方法利用免疫组织化学检测30例乳腺癌临床标本Smad4和TGF-β1、TGF-βR1蛋白表达，免疫细胞化学检测MCF-7、T47D、SKBR-3三种乳腺癌细胞的TGF-β1、TGF-βR1和Smad4蛋白表达，Western 印迹检测乳腺癌TGF-βR1和Smad4蛋白表达，分析三种乳腺癌细胞TGF-β1、TGF-βR1和Smad4蛋白表达情况。结果免疫组化法结果显示，Smad4和TGF-βR1的表达水平在低度恶性的MCF-7细胞中明显高于高度恶性的SKBR-3细胞，中度恶性的T47D细胞介于二者之间。病理类型非浸润性癌组，TGF-β1、TGF-βR1及Smad4的表达水平明显高于恶性程度高的浸润性癌患者组，早期浸润性癌组介于二者之间。 Western 印迹显示，恶性程度低的MCF-7细胞，其TGF-βR1和Smad4的蛋白含量明显高于恶性程度高度的SKBR-3细胞。恶性程度低的患者TGF-βR1和Smad4的蛋白含量明显高于恶性程度高的患者。结论TGF-β/Smads信号传导通路活性与乳腺癌的恶性程度呈负相关，Smad4、TGF-β1、TGF-βR1可能在乳腺癌演变中起抑制作用。

关键词〔〕转化生长因子β1；转化生长因子β1受体；Smad4；乳腺癌

1南方医科大学附属南方医院

第一作者：陈国平(1978-)，男，主治医师，主要从事肿瘤外科治疗及机制研究。

诸多研究显示，原癌基因的激活及抑癌基因的失活参与了乳腺癌的发生发展，该病涉及多基因的改变，是一个多因素多阶段的演变进程〔1,2〕。转化生长因子(TGF)- β/Smads信号传导通路与胰腺及妇科肿瘤的演变有关〔2〕，而在乳腺癌中Smad4、TGF-β1及TGF-βR1三者的表达与相互关系如何，它们对乳腺癌发生、发展起何作用，目前尚未明确。

1材料与方法

1.1标本和细胞选取2005年1月至2008年12月海南医学院附属医院收治的门诊或住院乳腺癌患者的临床标本共30例，其中25例为手术切除标本，5例为病理活检标本。年龄64～80岁，中位年龄73岁；按照病理结果分为非浸润性癌4例、早期浸润性癌6例及浸润性癌20例。选取非乳腺癌患者手术切除的正常乳腺组织10例作为对照。乳腺癌细胞株MCF-7、T47D、SKBR-3均为本实验室保存。

1.2试剂兔抗人TGF-β1、TGF-βR1及生物素标记的羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司；Smad4抗体购自Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒和硝酸纤维素膜和辣根过氧化酶(HRP)标记的抗兔二抗购自威佳公司。

1.3免疫细胞化学、免疫组织化学检测取细胞滴片或组织块切片，参照使用说明书进行固定、血清封闭、孵育、洗涤、二氨基联苯胺(DAB)显色等步骤，以兔抗人TGF-β1、TGF-βR1和Smad4为一抗，生物素标记的羊抗兔IgG为二抗，采用SP法进行免疫细胞化学及免疫组织化学检测。

1.4Western 印迹分析蛋白表达水平取指数增长的MCF-7、T47D、SKBR-3三种乳腺癌细胞和临床乳腺癌患者标本，提取总蛋白，检测蛋白含量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜、封闭、抗体孵育、曝光、显影、凝胶成像等步骤，按试剂盒说明书测定蛋白含量。

2结果

2.1免疫细胞化学法检测乳腺癌细胞中Smad4和TGF-βR1的表达恶性程度低的MCF-7细胞中Smad4和TGF-βR1的表达水平明显高于恶性程度高的SKBR-3细胞。中度恶性的T47D细胞的Smad4和TGF-βR1表达水平介于二者之间。见图1。

2.2免疫组织化学法检测乳腺癌临床标本中TGF-β、TGF-βR1和Smad4的表达病理类型非浸润性癌组，TGF-β1、TGF-βR1和Smad4的表达水平明显高于恶性程度高的浸润性癌患者组。早期浸润性癌组TGF-β1、TGF-βR1和Smad4表达水平基本介于二者之间。见图2～图4。

2.3Western 印迹分析蛋白表达水平恶性程度高的SKBR-3细胞中TGF-βR1和Smad4的蛋白表达量明显低于恶性程度低的MCF-7细胞。临床患者中，恶性程度高患者组TGF-βR1和Smad4的蛋白表达量明显低恶性程度低的患者组。见图5。

SKBR-3细胞(+)　　T47D细胞(+)　　　MCF-7细胞()图1　免疫细胞化学法检测细胞中Smad4蛋白表达(×400)

Smad4(+)　　　　　TGF-βR1(+)　　　TGF-β1(+)图2　晚期浸润性癌组TGF-βR1、Smad4和TGF-β1蛋白表达(×400)

TGF-βR1()　　　　Smad4()　　　　　TGF-β1()图3　早期浸润性癌组TGF-βR1、Smad4和TGF-β1蛋白表达(×400)

TGF-βR1()　　　　Smad4(+)　　　　TGF-β1()图4　非浸润性癌组TGF-βR1、Smad4和TGF-β1蛋白表达(×400)

3讨论

TGF-β超家族是一类具有多种生物学活性的细胞生长因子，在调节细胞生长、分化、凋亡、黏附、细胞外基质(ECM)合成及沉积中起重要的作用，并且还参与了胚胎发生和组织修复、炎症反应与纤维化等病理生理进程。TGF-β可通过下游的信号传导途径放大并传入细胞核内，调节细胞核内的增殖周期调节子、转录调节子等，从而对细胞的增殖发挥重要的调节作用〔3〕。TGF-β与细胞膜表面具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ结合，形成异聚体复合物，激活细胞内相应的信号传导〔4〕。抑制型Smad(Ⅰ-Smad)可通过阻断受体下游R-Smad的磷酸化，启动泛素化作用，抑制TGF-β/Smads信号传导通道的传导。该信号通路中的任一个传导环节的错误，传导蛋白的突变失活或者表达异常，都会导致机体细胞TGF-β生物学效应的丢失，丧失对肿瘤的抑制作用。

国外研究发现〔4〕，与众多肿瘤一样，TGF-β在乳腺癌演变过程中扮演着不同的角色。在乳腺癌中，TGF-β负性调控作用能抑制肿瘤生长，调控肿瘤DNA损伤，阻碍肿瘤控制。Smad4作为 TGF-β信号通路最常见的转导子，对乳腺癌发生及发展同样起抑制作用〔5〕。另有研究发现，乳腺癌细胞株中雌激素受体阳性者，Smad4 能通过诱导细胞凋亡抑制乳腺癌生长〔6〕；并且在乳腺上皮细胞 Smad4 基因敲除裸鼠中，几乎100%雌鼠演变成为乳腺鳞状上皮癌，而雄鼠几乎没有，显示Smad4基因与乳腺癌密切相关，Smad4可能通过雌激素受体途径抑制乳腺癌发生、发展〔7〕。本研究认为：①TGF-β/Smads信号传导通路参与了乳腺癌发生、发展过程；②TGF-β/Smads信号传导通路活性与乳腺癌恶性程度呈负相关，Smad4、TGF-β1、TGF-βR1可能对乳腺癌演变进程起抑制作用。

参考文献4

1Hudis CA.Current status and future directions in breast cancer therapy〔J〕.Clin Breast Cancer,2003；4(2):S70-5.

2陈可欣,何敏,董淑芬，等.天津市女性乳腺癌发病率死亡率和生存率分析〔J〕.中华肿瘤杂志,2002；24(6):573-5.

3Heldin CH,Landstrom M,Moustakas A,etal.Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest,apoptosis,and epithelial-mesenchymal transition〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2009；21(2):166-76.

4Dunning AM,Ellis PD,McBride S,etal.A transforming growth factorbeta1 signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer〔J〕.Cancer Res,2003;63(10):2610-5.

5Kaklamani VG,Baddi L,Liu J,etal.Combined genetic assessment of transforming growth factor- β signaling pathway variants may predict breast cancer risk〔J〕.Cancer Res,2005;65(8):3454-61.

6Li Q,Wu L,Oelschlager DK,etal.Smad4 inhibits tumor growth by inducing apoptosis in estrogen recep-tor -α -positive breast cancer cells〔J〕.J Biol Chem，2005;280(29):27022-8.

7Li W,Qiao W,Chen L,etal.Squamous cell carcinoma and mammary abscess formation through squamous metaplasia in Smad4/ Dpc4 conditional knockout mice〔J〕.Development,2003;130(24):6143-53.

〔2015-01-17修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者：范平明(1980-)，男，副主任医师，主要从事肿瘤外科治疗及机制研究。

基金项目：海南医学院科研基金资助项目(0020100191)

中图分类号〔〕R737.9〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7009-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.019