钟　丹　邹亦平　延卫东　黄宇清　陈小丽　王　娟

(井冈山大学临床医学院，江西　吉安　343009)



丹参对单侧输尿管结扎模型大鼠肾脏核因子-κB及氧化物酶体增殖物激活受体-γ表达的影响

钟丹邹亦平1延卫东黄宇清陈小丽1王娟

(井冈山大学临床医学院，江西吉安343009)

摘要〔〕目的探讨丹参对单侧输尿管结扎(UUO)所致肾间质纤维的影响及可能机制。方法应用UUO建立肾间质纤维化大鼠模型，丹参干预组按剂量高低分为低剂量组，中剂量组，高剂量组，各组均从模型建立前48 h开始灌胃，于造模后第7天，留取梗阻侧肾脏行HE、Masson染色，观察肾组织病理结构变化，采用免疫组化方法检测肾组织核因子(NF)-κB及氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ的表达，RT-PCR方法检测NF-κB及PPAR-γ mRNA的表达。结果UUO模型组大鼠肾组织可见肾小管上皮细胞变性、间质炎性细胞浸润、纤维组织增生等病理变化，丹参各剂量组与UUO模型组大鼠相比较均有不同程度的改善，其中以丹参高剂量组改善最为明显。与空白组相比较，UUO 模型组中NF-κB表达明显增高，PPAR-γ表达明显降低。丹参高、中剂量组NF-κB表达水平明显低于UUO 模型组，丹参高剂量组PPAR-γ表达增强，与UUO模型组相比较有显著差异。结论丹参可通过抑制NF-κB的表达，增强PPAR-γ的表达，从而起到肾脏保护和抗肾间质纤维化的作用。

关键词〔〕丹参；肾间质纤维化；核因子-κB；氧化物酶体增殖物激活受体-γ

1井冈山大学附属医院

第一作者：钟丹(1974-)，男，副教授，副主任医师，博士，主要从事肾脏疾病的临床、教学和科研工作。

肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的共同机制，传统中医理论认为瘀血是肾脏疾病发生发展过程中重要的病理因素，活血化瘀在慢性肾脏疾病的治疗中占有重要地位。丹参在心脑血管系统及肾脏疾病中作用显著。本研究观察丹参对单侧输尿管结扎(UUO)大鼠模型肾组织核因子(NF)-κB及氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ表达的影响，以进一步阐明该药抗肾间质纤维化的可能作用机制。

1材料与方法

1.1材料健康SD雄性大鼠，体质量(200±10)g，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0003467。饲以标准大鼠合成饲料，自由饮用大鼠专用无菌水。丹参水煎液由本课题组成员自行制备。吡格列酮购自杭州中美华东制药有限公司，国药准字H20050500。Trizol RNA提取试剂盒、Platinum Taq DNA Polymerase、ThermoScript RT-PCR System 试剂盒(Invitrogen公司)；兔抗鼠NF-κB、两步法免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2分组造模及给药120只大鼠随机均分为：空白组、模型组，吡格列酮组，丹参高、中、低剂量组。采用UUO〔1〕造模方法，各组均于模型建立前48 h灌胃，丹参灌胃量分别按3、2、1 g·kg-1·d-1灌胃给药，每日给药一次。模型组以等量生理盐水灌胃。吡格列酮组灌胃量为30 mg·kg-1·d-1。

1.3病理检测以造模后第7天为观察时点，处死各组大鼠，取新鲜肾组织，以10%中性甲醛固定后，分别行HE 染色及Masson 染色，光镜下观察肾小管间质的结构变化，同时进行肾间质慢性病变(包括肾小管萎缩和间质纤维化)评分：200倍光镜下盲法随机取互不重叠的10个视野，间质纤维化：无(0分)、<相应视野区域25%(1分)、相应视野25%～50%(2分)、>相应视野50%(3分)；肾小管萎缩：无(0分)、<相应视野区域25%(1分)、相应视野25%～50%(2分)、>相应视野50%(3分)。由两个观察者对每个样本肾组织进行盲法评分，取平均值，代表各样品的肾小管间质损伤程度。

1.4免疫组化检测免疫组化染色采用SP法步骤：3 μm石蜡切片脱蜡，水化后以3%H2O2去离子水孵育，以阻断内源性过氧化物酶，抗原热修复，正常山羊血清封闭后，分别滴加一抗NF-κB、PPAR-γ孵育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液孵育。应用DAB溶液显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。每次染色均以PBS代替一抗做阴性对照。在每张切片不包含肾小球和血管的间质区域随机选取10个高倍镜视野(×200)，用彩色病理图文报告分析系统对所选取视野中免疫组化阳性信号进行图像分析，计算每个视野中NF-κB、PPAR-γ各自阳性染色面积占总视野面积的百分比，并计算其均值。

1.5NF-κB mRNA、PPAR-γ mRNA的检测采用RT-PCR技术：应用Trizol试剂盒提取肾组织总RNA，运用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，以β-actin为内对照，进行半定量逆转录聚合酶链反应。引物设计如下：NF-κB：上游引物5'-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3'，下游引物5'-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3'，扩增片段长度1 872 bp。PPAR-γ：上游引物5'-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3'，下游引物5'-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3'，扩增片段长度250 bp。β-actin：上游引物5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3'，下游引物：5'-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG-3'，扩增片段长度为216 bp。均经测序鉴定证实。聚合酶链反应条件根据RT-PCR试剂盒推荐条件优化，每次PCR反应至少重复3次。PCR产物用含0.5 mg/L溴乙啶的1.5%琼脂凝胶电泳分析。根据双标准曲线法，以目的基因与β-actin基因mRNA水平比值作为目的基因mRNA的相对表达量，比值越大，说明目的基因的表达越少。

1.6统计学方法采用SPSS13.0统计软件包进行单因素方差分析，方差不齐者改用秩和检验的Kruskal-Wallish方法。

2结果

2.1丹参对模型大鼠肾脏组织病理形态的影响HE、Masson 染色观察：UUO 模型组出现肾间质炎细胞浸润，纤维组织增生，伴有大部分肾小管上皮细胞颗粒、空泡变性，部分肾小管上皮细胞坏死脱落，可见肾小管灶状萎缩，部分肾小管腔可见脱落坏死组织及细胞形成颗粒管型及细胞管型；吡格列酮组、丹参组病理变化较UUO模型组减轻，其中尤以丹参高剂量组减轻最明显。肾间质病变积分显示，与模型组(2.005±0.033)比较，空白组、吡格列酮组、丹参高、中、低剂量组积分均降低(0.288±0.13、1.573±0.115、1.456±0.127、1.780±0.083、1.833±0.143)；与吡格列酮组比较，丹参高剂量组降低差异显著(P<0.05)。

2.2各组大鼠肾组织NF-κB及PPAR-γ的表达与空白组比较，模型组肾小管上皮细胞、肾间质细胞核NF-κB 强阳性表达，吡格列酮组及丹参各剂量组NF-κB 表达水平低于UUO 模型组(P<0.05)；与空白组相比较，模型组及各治疗组PPAR-γ表达明显降低(P<0.05)，与模型组比较，丹参高、中剂量组PPAR-γ表达增高，其中丹参高剂量组表达增高有统计学(P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠肾组织NF-κB mRNA及PPAR-γ mRNA的表达与空白组比较，模型组NF-κB mRNA表达明显增强(P<0.01)；各药物治疗组NF-κB mRNA的表达均较模型组降低，但组间差异不明显。与空白组比较，模型组PPAR-γ mRNA明显降低(P<0.05)，各药物治疗组PPAR-γ mRNA的表达均较模型组升高(P<0.05或P<0.01)，与吡格列酮组比较，丹参高剂量组PPAR-γ mRNA的表达升高明显(P<0.05)。见表2。

组别阳性表达面积NF-κBPPAR-γ空白组0.48±0.230.32±0.10模型组2.68±0.232)0.27±0.181)吡格列酮组0.97±0.213)0.28±0.111)丹参高剂量组0.68±0.263)0.30±0.013)丹参中剂量组0.81±0.563)0.28±0.011)丹参低剂量组0.89±0.333)0.27±0.011)

与空白组比较：1)P<0.05;2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05

组别NF-κBPPAR-γ空白组1.29±0.221.25±0.16模型组1.13±0.331)1.62±0.121)吡格列酮组1.26±0.161.27±0.212)丹参高剂量组1.32±0.761.20±0.333)4)丹参中剂量组1.23±0.351.25±0.673)丹参低剂量组1.24±0.121.26±0.323)

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05;3)P<0.01；与吡格列酮组比较：4)P<0.05

3讨论

大量研究资料表明〔2,3〕，各种肾脏疾病在发生发展过程都会出现不同程度的炎症细胞浸润、肾小管萎缩、肾间质纤维化等一系列病理过程。肾间质纤维化的程度是决定肾脏疾病预后的最重要因素之一。UUO模型由于尿液排出受阻，肾盂及肾小管压力增高，肾盂等集合管系统扩张，肾间质水肿，局灶性炎症细胞浸润，最终导致肾间质纤维化。

NF-κB在多种组织器官损伤中具有中心调控作用，可参与促进炎症性细胞因子和趋化因子的产生、成纤维细胞的增生分化、ECM交联及细胞凋亡等过程，并参与了肾组织损害过程，促进肾脏疾病的进展。因此在许多肾脏疾病发生发展过程中的作用不容忽视，特别是其致炎及致纤维化作用〔4〕。

PPARs是一类配体激活的核转录因子超家族成员之一。已经证实肾脏组织和细胞中表达PPARs，并且在慢性肾脏病进展过程中，PPAR-γ表达量呈下降趋势。在UUO大鼠模型中，肾组织PPAR-γ表达增加，阿伐他汀可以显著增加PPAR-γ表达，从而改善肾间质纤维化〔5,6〕。

中医学〔7〕认为肾纤维化的形成主要由气滞血瘀、痰湿交阻、经络闭阻等相互影响而成，治疗上主要以活血化瘀、攻毒泄浊散结为主。病程中肾脏病理学得改变、凝血机制的激活以及微血栓的形成均与中医学所说“血瘀”理论相符。研究〔8〕表明活血化瘀药物是临床抗纤维化最常使用的一类药物，而丹参在此类药物中的使用频率最高。

本研究结果表明：丹参在肾间质纤维化早期可以通过抑制NF-κB 的表达，上调PPAR-γ的表达，从而减轻肾小管间质的微观病理损害，起到抗肾小管-间质纤维化的作用，而且这种作用具有剂量的依赖性，以丹参大剂量效果最为明显。

参考文献4

1刘克剑,张悦,李靖,等.单侧输尿管梗阻法制作大鼠肾间质纤维化模型的改进〔J〕.中国实验动物学报,2007；15(6):410-3.

2Neilson EG.Mechanisms of disease:fibroblasts-a new look at an old problem〔J〕.Nat Clin Pract Nephrol,2011；26(3):347-51.

3Eddy AA.Progression in chronic kidney disease〔J〕.Adv Chronic Kidney Dis,2005；12:353-65.

4Volpini RA,Costa RS,Da Silva CG,etal.Inhibition of nuclear factor-kappaB activation attenuates tubulointerstitial nephritis induced by gentamicin〔J〕.Nephron Physiol,2004；98(4):97-106.

5Kimura H,Li X,Torii K,etal.A natural PPAR-γ agonist 15-deoxy-delta 12,14-prostaglandin J2 may act as an enhancer of PAI-1 in human proximal renal tubular cells under hypoxic and inflammatory conditions〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2008；23(4):2496-503.

6刘斌，陈明，彭红霞，等.阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响〔J〕.中国危重病急救医学,2007；19(12):739-41.

7沈庆法.中医临床肾脏病学〔M〕.上海：上海中医药大学出版社，2007:63.

8贾秀琴，李雪梅.中药抗肾纤维化用药规律探析〔J〕.中国中西医结合肾病杂志,2006；12(7):739-40.

〔2014-12-09修回〕

(编辑曹梦园)

基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目(No.GJJ12479)

中图分类号〔〕R285.5〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7003-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.016