何　筑　况时祥　张树森　邹家莉　杨　燕　崔冬冰

(贵阳市第三人民医院，贵州　贵阳　550002)



脑通汤对缺氧/复氧大鼠海马神经元Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响

何筑况时祥1张树森1邹家莉1杨燕2崔冬冰2

(贵阳市第三人民医院，贵州贵阳550002)

摘要〔〕目的探讨脑通汤对缺氧/复氧(H/R)大鼠海马神经元Bcl-2、Bax和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达的影响及防治海马神经元凋亡的作用机制。方法取培养9 d的海马神经元，随机分为正常细胞组、H/R模型组、正常血清组、脑通汤大、中、小剂量含药血清组。除正常细胞组以外，各组均缺氧24 h再复氧2 h造模。采用免疫组化检测海马神经元Bcl-2、Bax蛋白表达；实时荧光定量PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表达。结果免疫组化显示：与正常细胞比较，模型组Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白表达明显升高、Bcl-2/Bax比值下调(P<0.05)。与模型组比较，脑通汤大、中、小剂量含药血清组Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显增高，Bax蛋白表达明显下降，呈剂量依赖性(P<0.05)；但正常血清组上述指标无显著变化(P>0.05)。实时荧光定量PCR显示：Bcl-2、Bax mRNA趋势同蛋白表达一致，Caspase-3 mRNA趋势同Bax mRNA表达一致。结论脑通汤可通过上调Bcl-2蛋白及基因表达和Bcl-2/Bax比值，抑制Bax及Caspase-3的过度表达，从而抑制H/R海马神经元凋亡。

关键词〔〕脑通汤；缺氧/复氧；海马神经元；Bcl-2；Bax；半胱氨酸蛋白酶3

1贵阳中医学院第二附属医院

2贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心

第一作者：何筑(1986-),女，硕士，主要从事血管性痴呆的研究。

脑通汤是在金元时期著名医家李东垣的益气升阳法的代表方益气聪明汤基础上化裁而来，具有补气升阳、化瘀通络、潜降浮阳之功。本课题前期临床及实验证实〔1～4〕，本方不仅可以改善血管性痴呆(VD)早期患者认知功能，改善VD大鼠学习及记忆能力，还可减轻VD大鼠海马CA1区的神经细胞凋亡。但本方干预海马神经细胞凋亡机制尚不十分明确。本实验拟观察脑通汤对缺氧/复氧(H/R)后海马神经元Bcl-2、Bax、半胱氧酸蛋白酶(Caspase)-3表达的影响，揭示本方抑制海马神经元凋亡的作用机制。

1材料与方法

1.1动物出生24 h以内SD大鼠，雄性，SPF 级，购自贵阳医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(黔)2012-0001。SD大鼠，雄性，SPF级，体重(200±20)g，购自予重庆腾鑫生物技术有限公司，许可证号：SCXK(渝)2012-0005。

1.2主要试剂、药品及仪器L-谷氨酰胺，Neurobasal-A Medium，B27无血清添加剂均购于Gibco 公司；多聚-L-赖氨酸(PLL)、DMEM-F12培养基、0.25%胰酶、青、链霉素双抗溶液均购于 HyCLone；胎牛血清(FBS，杭州四季青)；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG、兔抗鼠Bcl-2(批号BA0412)、兔抗鼠Bax(批号BA0315-1)均购于武汉博士德生物工程有限公司；PV-6001两步法免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；台盼蓝染液(Sigma)；Trizol(批号1596-026，invitrogen公司)；SYBR Green PCR 试剂盒(批号K0223，Thermo公司)；逆转录试剂盒(批号K1622，Fermentas公司)；异丙醇(批号80109218)、无水乙醇(批号100092680)、氯仿(批号10023419)，国药集团化学试剂公司；水合氯醛(天津市富宇精细化工有限公司)；无糖DMEM(Gibco公司)；脑通汤由贵阳中医学院第二附属医院中药房提供；SW-CJ-1D超净工作台(苏州净化设备有限公司)；LD4-2低速离心机(北京医用离心机厂)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；Galaxy170R三气培养箱(英国New Brunswick)；CTH4-200荧光显微镜(日本Olympus公司)；TE2000倒置显微镜(日本Nikon)；MIAS 图像分析系统(四川大学图像图形研究所提供)，ABI-7300Real-time检测仪(ABI公司)；TG-16M低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；K30旋涡振荡器(青浦泸西仪器厂)；PRO200电动匀浆机(FLUKO)；Tanon 2500R全自动数码凝胶成像分析系统、Tanon HE-120水平电泳槽、Tanon EPS300电泳仪均为上海天能公司；K2800核酸检测仪(北京凯恩公司)。

1.3脑通汤含药血清的制备脑通汤(组成：黄芪40 g、西洋参8 g、天麻20 g、水蛭24 g、葛根60 g)每剂方药152 g，加水500 ml煎制，醇沉提取，高温消毒，制成含生药量为3.04 g/ml(大剂量脑通汤组)、1.52 g/ml(中剂量脑通汤组)、0.76 g/ml(小剂量脑通汤组)。SD大鼠60只，随机分为正常对照组和大、中、小剂量脑通汤组，每组15只。参照《药理实验方法学》〔3〕换算出灌胃给药量：大、中、小剂量脑通汤组分别为(15.2、7.6、3.8 g·kg-1·d-1)，正常对照组灌服生理盐水10 ml·kg-1·d-1〔6〕)，2次/d，连续灌胃4 d，末次灌胃2 h后，10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)麻醉，无菌股动脉采血，常温静置4 h，离心(3 000 r/min，20 min)，分离血清，混匀同组血清，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，56℃水浴箱中灭活30 min，-20℃冰箱保存备用。

1.4海马神经元原代培养选择10只出生24 h以内SD大鼠，脱颈处死，浸泡于75%酒精中1 min，断头，于显微镜下剥离双侧海马，放入预冷的D-hank液中冲洗2～3遍。将组织剪成1 mm3的组织块，用移液枪转移至15 ml离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，消化15 min，消化完毕加入适量种植培养基(89%DMED-F12、10%胎牛血清和1%双抗)，终止消化5 min，再200目筛网过滤制成细胞悬液，离心(800～1 000 r/min，5 min)，弃上清，加入适量种植培养基，吹打混匀制成细胞悬液。放入培养箱差速贴壁1 h后，台盼蓝拒染试验染色计数，按1.0×105～1.0×106个/ml的密度接种于PLL包被过的六孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱内孵育。24 h后，第一次全量换成无血清培养基(97%Neurobasal、2%B27和1% L-谷氨酰胺)继续孵育，每隔2～3 d换液1次。

1.5海马神经元H/R模型的建立与分组取生长9 d的海马神经元，随机分为正常细胞组：正常海马神经元；H/R模型组：海马神经元+H/R；正常血清组：海马神经元+H/R+正常血清；脑通汤大剂量含药血清组：海马神经元+H/R+脑通汤大剂量含药血清；脑通汤中剂量含药血清组：海马神经元+H/R+脑通汤中剂量含药血清；脑通汤小剂量含药血清组：海马神经元+H/R+脑通汤小剂量含药血清。除正常细胞组以外，均参考文献〔5〕根据本课题的具体要求稍加改良，制备细胞H/R模型：用无糖DMEM洗涤2次，H/R模型组换液无血清培养基，其余四组于H/R时依次加入无FBS配制而成的含10%SD大鼠正常血清及含10%脑通汤大、中、小剂量含药血清培养基(分别用89%的无EBS的DMEM培养基、1%双抗和10%正常血清或10%不同剂量含药血清配制而成)，将这五组全置入37℃三气培养箱，持续通入(95%N2+5%CO2)混合气体，流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h后，H/R模型组换液无血清培养液继续培养，其余四组全量换液相应含10%SD大鼠正常血清及10%脑通汤大、中、小剂量含药血清培养基，再将这三组放回37℃、5%CO2培养箱持续孵育2 h。正常细胞组用无血清培养基正常培养26 h，不做任何处理。

1.6免疫组化检测海马神经元 Bcl-2、Bax 蛋白表达采用免疫组化PowervisionTM二步法试剂盒操作。操作完成后，利用病理图像采集系统采图，每张切片随机选取5个高倍(×400)阳性细胞视野；利用MIAS图像分析系统对神经细胞Bcl-2和Bax蛋白进行阳性细胞平均光密度值(OD值)的测定与分析。

1.7实时荧光定量PCR法检测海马神经元Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达各引物均由上海基尔顿生物科技有限公司设计。引物序列：Bcl-2上游：5′ GGGATGCCTTTGTGGAAC 3′，下游：5′ GTCTGCTGACCTCACTTG 3′，扩增长度148 bp；Bax上游：5′ GGACGCATCCACCAAGAAG 3′，下游：5′ CTGCCACACGGAAGAAGAC 3′，扩增长度 134 bp；Caspase-3：上游：5′ GGCATCTCCTGTGATTGG 3′，下游：5′ CTCAGCACTCTGGGAAAG 3′，扩增长度 185 bp；内参β-actin：上游：5′ GTCGGTGTGAACGGATTTG 3′，下游：5′ TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3′，扩增长度 181 bp。

按Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，然后按照SYBR Green PCR 试剂盒说明，采用实时荧光定量RT-PCR反应(两步法)进行目的基因和内参基因的PCR反应。反应总体积25 μl，PCR 反应参数：预变性。95℃，10 min；变性 95℃，15 s；退火60℃，45 s，延伸60℃，1 min，总共40次循环。反应结束时由电脑自带软件与PCR反应软件ABI Prism 7300SDS Software自动输出结果及PCR扩增产物生成曲线，运用2-△△CT方法计算样本目的基因相对表达量〔6〕。公式如下：样品目的基因△CT=样品目的基因CT值-内参基因CT值；△△CT=样品目的基因△CT值-对照组△CT值。

2结果

2.1脑通汤对海马神经元H/R后 Bcl-2、Bax蛋白表达的影响免疫组化结果显示：海马神经元Bcl-2、Bax蛋白阳性细胞染色呈棕黄色，主要存在于胞质和突起，胞核有少许黄色颗粒。正常细胞组Bcl-2有大量阳性细胞表达、染色较深；而Bax蛋白没有或仅有少量阳性细胞表达、染色较浅。与正常细胞组比较H/R，模型组Bcl-2阳性细胞表达减少，染色变浅及平均光密度值下降(P<0.05)；而Bax蛋白有大量阳性细胞表达，染色较深，平均光密度值表达明显增加(P<0.05)，且Bcl-2/Bax 比值下调。与H/R模型组比较，脑通汤大、中、小剂量含药血清组Bcl-2 阳性细胞表达逐渐增加，染色变深及平均光密度值均升高(P<0.05)，而Bax蛋白阳性细胞表达逐渐减少、染色变浅及平均光密度值表达均下降(P<0.05)，且Bcl-2/Bax 比值上调。脑通汤大剂量中药组上述指标显著表达，呈剂量依赖性(P<0.01)，但正常血清组与模型组比较，Bcl-2、Bax蛋白表达以及Bcl-2/Bax 比值无显著变化(P>0.05)。见图1，图2，表1。

A：正常细胞组；B：H/R模型组；C：正常血清组；D：脑通汤大剂量含药血清组；E：脑通汤中剂量含药血清组；F：脑通汤小剂量含药血清组，下图同图1　海马神经元Bcl-2阳性细胞形态学观察(×400)

图2　海马神经元Bax蛋白阳性细胞形态学观察(×400)

组别Bcl-2BaxBcl-2/Bax正常细胞组0.45±0.030.17±0.0190.901±0.027H/R模型组0.11±0.011)3)0.42±0.211)3)0.599±0.0381)3)正常血清组0.10±0.000.41±0.0180.563±0.046脑通汤大剂量含药血清组0.35±0.022)3)0.23±0.0222)3)0.824±0.0102)3)脑通汤中剂量含药血清组0.29±0.022)0.31±0.0162)0.750±0.0152)脑通汤小剂量含药血清组0.24±0.022)0.35±0.0902)0.651±0.0182)

与正常细胞组比较:1)P<0.05；与H/R模型组比较:2)P<0.05，且3)P<0.01；下表同

2.2脑通汤对H/R后海马神经元Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达的影响实时荧光定量PCR显示：Bcl-2、Bax mRNA的相对表达量与其蛋白表达趋势一致，而Caspase-3 mRNA的相对表达趋势与Bax mRNA表达趋势一致。见表2。

组别Bcl-2mRNA(2-△△CT)BaxmRNA(2-△△CT)Caspase-3mRNA(2-△△CT)正常细胞组4.748±1.5890.224±0.0390.187±0.043H/R模型组0.23±0.081)4.58±0.821)5.64±1.401)正常血清组1.096±0.4022)0.958±0.1922)0.838±0.122)脑通汤大剂量含药血清组3.226±0.6452)3)0.292±0.0412)3)0.323±0.0632)3)脑通汤中剂量含药血清组2.529±0.6742)0.385±0.0572)0.496±0.0872)脑通汤小剂量含药血清组2.201±0.6662)0.621±0.1332)0.803±0.1682)

3讨论

VD是指由各种缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的以记忆认知功能缺陷为主，伴有语言、情感或人格障碍的一种获得性智能损害综合征，其中缺血性脑血管病是VD发生的主体病因〔7〕。脑缺血再灌注损伤参与并介导缺血性脑血管病的重要病理生理过程，在这个复杂的病理生理过程中涉及多种机制及多个环节，其中细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的重要环节之一〔8〕。研究发现，体外培养的神经细胞H/R过程中的病理生理改变类似于体内的缺血/再灌注损伤〔9〕。研究证实〔10〕，在局部或全脑缺血引起的神经细胞死亡中以细胞凋亡为主。目前发现，多途径多因素介导脑缺血再灌注损伤所致神经细胞凋亡，在脑缺血介导的神经细胞凋亡通路中主要是依赖Caspase线粒体介导的凋亡通路和死亡受体介导的凋亡通路。其中Caspases-3 是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，被认为是凋亡的最终执行者〔11〕。已有研究报道，全脑缺血再灌注损伤可诱导凋亡相关蛋白及基因Caspase-3表达的增高，导致神经细胞凋亡〔12〕。刘丽等〔13〕实验证实，通过药物抑制或基因干预Caspase-3表达，均可对脑缺血再灌注损伤的神经细胞凋亡产生保护作用。Cheng等〔14〕研究进一步证实，Casepase-3也可裂解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去活性，促进细胞凋亡。

此外，在参与脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡过程中，Bcl-2家族也发挥了重要的调控作用。Bcl-2家族可以分为两类：一类是以Bcl-2基因为代表的抗细胞凋亡基因；另一类是以Bax 基因为代表的促细胞凋亡基因。 细胞凋亡是一种受基因调节的复杂的自主过程，在这个过程中Bcl-2 与 Bax 虽是同一家族，但其作用却截然相反，Bcl-2 占优势，保护细胞存活，Bax占优势，导致细胞凋亡，Bax主要通过抑制Bcl-2的功能促进凋亡，两者之间的比例决定着细胞受到刺激后是凋亡还是存活〔15〕。大量研究证实，通过上调抗细胞凋亡基因Bcl-2及Bcl-2/Bax的比值，抑制促细胞凋亡基因Bax，能显著减少缺血再灌注后神经细胞凋亡〔16〕。

综上所述在H/R损伤中，以促细胞凋亡基因及凋亡执行基因占主导地位，因而导致海马神经细胞凋亡的趋势增加。脑通汤能很好地抑制凋亡相关基因的表达，促进抗细胞凋亡基因的表达，从而发挥对抗细胞凋亡的作用，保护海马神经元。概言之，脑通汤可通过上调抗细胞凋亡基因Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值，抑制促凋亡基因Bax及细胞凋亡最终执行者Caspase-3基因的过度表达，从而发挥抗神经细胞凋亡的作用。

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〔2015-02-17修回〕

(编辑袁左鸣)

The effects of Naotong soup on the expressions of bcl-2,bax,Caspase-3 after hypoxia / reoxygenation in hippocampal of rats

HE Zhu,KUANG Shi-Xiang,ZHANG Shu-Sen，etal.

Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，Guizhou，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Naotong soup on the expressions of bcl-2,bax and Caspase-3 hypoxia/reoxygenation(H/R)in hippocampal of rats.MethodsThe hippocampal neurons cultured for 9 d were randomly divided into normal cell,H/R model,normal serum,large,medium and small doses of Naotong soup medicinal serum groups.The expressions of Bcl-2 and Bax protein of hippocampal neurons were detected by immunohistochemistry.Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect Bcl-2,Bax and Caspase-3 genes expressions.ResultsCompared with those of normal cell group,the expressions of Bcl-2 protein and Bcl-2/Bax were decreased(P<0.05).However，the expression of Bax protein was significantly increased.Compared with those of model group,the expressions of Bcl-2 protein and Bcl-2/Bax were significantly increased in Naotong soup medicinal serum groups，and Bax protein was decreased too(P<0.05).However,the normal serum group showed no significant change(P>0.05).Bcl-2 and Bax mRNAs trend was consistent with the expression of the protein,and Caspase-3 mRNA trend expression was consistent with Bax mRNA.ConclusionsNaotong soup could suppress H/R neuronal apoptosis through upregulating the expressions of Bcl-2 protein and gene and Bcl-2/Bax，meanwhile，it could inhibit the expressions of Bax and Caspase-3.

【Key words】Naotong soup;Hypoxia/reoxygenation;Hippocampal neurons;Bcl-2;Bax;Caspase-3

通讯作者：况时祥(1962-)，男，教授，硕士，硕士生导师，主任医师，主要从事中西医结合防治老年期痴呆临床与基础研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81160490)

中图分类号〔〕R28〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-6973-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.004